Норсвестерн-блот — це експериментальна техніка в молекулярній біології, що певною мірою є комбінацією вестерн-блоту та нозерн-блоту; в результаті норсвестерн-блот експерименту можливо виявити взаємодії між РНК та білками. Споріднена техніка, вестерн-блот, використовується для виявлення окремих білків у складних сумішах за допомогою розділення гель-електрофорезом, переносом продуктів розділення на нітроцелюлозну мембрану та обробку мембрани специфічним антитілом з барвником для детекції. Інша споріднена техніка, нозерн-блот, використовується для виявлення РНК; при цьому комплементарні гибридизаційні олігонуклеотиди-зонди використовуються замість антитіл для обробки мембрани з продуктами електрофоретичного розділення. Норсвестерн-блот поєднує в собі елементи вестрен-блоту та нозерн-блоту, що дозволяє специфічно виявляти РНК-білкові взаємодії.
Історія
Едвіном Саузерном було створено експериментальну методику, що дістала назву саузерн-блот, яка дозволяла детекцію молекул ДНК у сумішах. Після розділення молекул ДНК у суміші за допомогою гель-електрофорезу, продукти розділення переносились на спеціальну мембрану; після цього мембрана оброблялась ізотопно-міченим олігонуклеотид-зондом комплементарним до послідовності, яку потрібно детектувати. Поява радіоактивних ділянок на мембрані сигналізує про наявність в ній цільової послідовності ДНК. Дуже швидко ця методика була адаптована для детекції інших біомолекул. Результатом стало виникнення вестерн-блоту (детекція білків), нозерн-блоту (детекція РНК), саузернвестерн-блоту (детекція ДНК-білкових взаємодій), істерн-блоту (детекція посттрансляційних модифікацій в білках) та власне норсвестерн-блоту (детекція РНК-білкових взаємодій).Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol.
Особливості техніки Першим етапом норсвестерн-блоту є розділення РНК-зв'язуючих білків за допомогою електрофорезу. Після цього розділені відповідно до заряду та молекулярної маси білки переносяться на нітроцелюлозну мембрану.
Далі, мембрана обробляються протеїн-вмісним блокуючим розчином, щоб уникнути неспецифічного зв'язування антитіл з мембраною. Після блокування, розчин певної конкурентної міченої РНК додається до мембрани та інкубується, що призводить до зв'язування РНК із відповідними РНК-зв'язуючими білками, якщо вони присутні на мембрані. Час інкубації залежить від концентрацій РНК та білку та константи дисоціації комплексу; типовий час інкубації складає приблизно одну годину. Після цього надлишок РНК відмивається (фосфатний буфер) а потім радіоактивна РНК, що зв'язалась з РНК-зв'язуючими білками, детектується за допомогою ауторадіографії.
Практичне застосування Цей метод дає змогу швидко визначити наявність, молекулярну масу та відносну кількість РНК-зв'язуючих білків. Цей метод може бути поєднаний з вестерн-блотом, щоб отримати додаткову інформацію щодо ідентичності окремих білків.
Переваги та недоліки Перевагою норсвестерн-блоту є можливість відносно швидко визначити кількість білків, які зв'язуються з певною послідовністю РНК. Він як правило є першим кроком в аналізі РНК-білкових взаємодій та дає первинну інформацію, яка необхідна для подальшого вивчення конкретних білків.
Недоліком методу є те, що певні РНК-білкові комплекси з малою константою асоціації не можуть бути ідентифіковані. Використання неоптимальних умов провдення окремих стадій призводить до низького відношення сигнал/шум, що також ускладнює інтерпретацію результатів. Окрім цього, необоротна денатурація білків також може призводити до неможливості ідентифікації їх РНК-зв'язуючих властивостей. Неможливим також є вивчення РНК-білкових комплексів, що включають декілька білкових субодиниць.
Див. також Саузерн-блот Вестерн-блот Нозерн-блот Саузвестерн-блот Істерн-блот Гель-електрофорез SDS-PAGE
Посилання