НАДН-дегідрогеназний комплекс

НАДН-дегідрогеназний комплекс, відомий також як комплекс I чи НАДН-убіхінон-оксидоредуктаза — перший багатобілковий комплекс дихального ланцюга мітохондрій. Багато копій комплексу містяться в мембранах прокаріотичних організмів, здатних до кисневого дихання та внутрішніх мембранах мітохондрій еукаріотичних клітин. Коли йдеться про комплекс як про біохімічну структуру людини, комплекс I часто називають НАДН-дегідрогеназою.

Цей комплекс відіграє центральну роль у процесах клітинного дихання та окисного фосфорилювання, адже майже 40 % протонного градієнту для синтезу АТФ утворюється саме цим комплексом. Комплекс I окиснює НАДН і відновлює одну молекулу убіхінону, яка вивільнюється в мембрану. На кожну окиснену молекулу НАДН комплекс переносить через мембрану чотири протони.

Комплекс I виділили з низки об'єктів: мітохондрій серця бика, цукрового буряка (Beta vulgaris), картоплі (Solanum tuberosum), бобів (Vicia faba), різушки Таля (Arabidopsis thaliana) та рису (Oryza sativa), а також із мітохондрій гриба нейроспори (Neurospora crassa) та мембран кишкової палички (Escherichia coli).

Структурна організація

У прокаріотів комплекс I складається з 14 основних субодиниць, що утворюють ядро комплексу, без якого він не в змозі функціонувати. Сім субодиниць є надзвичайно гідрофобними та локалізуються в мембрані, а сім відносно гідрофільних перебувають поза мембраною. В еукаріотів унаслідок еволюції комплекс покрився «шубою» з близько 30 допоміжних субодиниць, їх кількість може змінюватись залежно від об'єкту. Так, у ссавців цей фермент складається з 44 субодиниць, а в гриба Yarrowia lipolytica — з 48. Унаслідок цієї «надбудови» молекулярна маса комплексу I збільшилась майже удвічі: з ~550 кДа в бактерій до ~1 МДа в мітохондріях.

Електронна мікроскопія довела, що комплекс I (як із бактерій, так і з мітохондрій) має характерну L-подібну форму. Через цю форму, а також через ніби пом'яту молекулярну поверхню, комплекс I одержав від вчених назву «старий черевик». Гідрофобна «підошва» представлена білками, вмонтованими в мембрану, а гідрофільна частина — «кісточка» — обернена до матриксу.

Чотири субодиниці убіхінон-зв'язувального модуля разом із субодиницями мембранної частини ферменту утворюють сайт зв'язування убіхінону, де він взаємодіє із залізосірковим кластером N2, приймає два електрони та відновлюється до убіхінолу. Кластер N2, останній у ряді кластерів, по яких електрони від НАДН переходять до убіхінону, припіднесений над мембраною на ~15 Å. Сама порожнина, в якій зв'язується убіхінон, є завдовжки 30 Å і може вмістити всю молекулу разом із довгим гідрофобним хвостом із семи ізопренових одиниць. Порожнина має вузький вхід, тож довгий гідрофобний ланцюг повинен набути певної конформації, яка збережеться протягом усієї ферментативної реакції. Наявність такого довгого та вузького сайту зв'язування є характерною рисою комплексу I. Усередині порожнини убіхінон взаємодіє з консервативними залишками тирозину та гістидину.

У грибів, тварин і судинних рослин принаймні 7 із 44 субодиниць, які утворюють мембранний домен, кодуються мітохондріальним геномом. У ссавців цих субодиниць є рівно сім. У рослин ДНК мітохондрій кодує дев'ять субодиниць: окрім семи субодиниць, які входять до складу гідрофобної частини комплексу, в ній закодовані дві субодиниці, гомологічні субодиницям 49 кДа та 30 кДа у ссавців, а решта компонентів перебувають під контролем ядерних генів. Однак ці дані, отриманні при дослідженні пластомів картоплі та різушки Таля, можуть виявитись недостовірними для інших видів рослин, а кількість закодованих у мітохондріях субодиниць може змінюватись від виду до виду. Так, у печіночника Marchantia polymorpha субодиниця NAD7, гомологічна поліпептиду 49 кДа, кодується ядерним геномом і транспортується в мітохондрії, а відповідний ген мітохондріальної ДНК перетворився в псевдоген і є нефункціональним.

Дослідження виявили, що за своїми властивостями комплекс I суттєво не відрізняється в об'єктів тваринного та рослинного походження. Однак у рослин наявні деякі специфічні субодиниці, які в деяких випадках надають комплексу функціональних особливостей. Аналіз комплексу I в Arabidopsis показує, що понад 30 % субодиниць є специфічними для рослин. Наприклад, частиною мембранного модуля рослинного комплексу I є так званий γ-карбоангідразний структурний модуль і L-галактоно-1,4-лактондегідрогеназа, яка водночас являє собою останній фермент мітохондріального шляху біосинтезу аскорбінової кислоти.

Таблиця основних (корових) субодиниць Основні субодиниціКороваЛюдинаКишкова паличкаРізушка ТаляОписКофакториПериферична рукаДегідрогеназний модуль75 кДаNDUFS1NuoG75 кДатранспорт електронівFe2S2 (N1b), 2 x Fe4S4 (N4 и N5), (N7)51 kDaNDUFV1NuoF51 кДазв'язування НАДН, транспорт електронівфлавін, Fe4S4 (N3)24 kDaNDUFV2NuoE24 кДаНесе допоміжний кластер N1aFe2S2 (N1a)Убіхінон-зв'язувальний модуль49 кДаNDUFS2NuoD (NuoCD)NAD730 kDaNDUFS3NuoCNAD9TYKYNDUFS8NuoI28,5 кДатранспорт електронів2 x Fe4S4 (N6a и N6b)PSSTNDUFS7NuoB20 кДатранспорт електронівFe4S4 (N2)Мембранна рука -ND1MT-ND1NuoHNAD1Протон-транслокувальний модульND2MT-ND2NuoNNAD2антипорт-подібний білокND3MT-ND3NuoANAD3ND4MT-ND4NuoMNAD4антипорт-подібний білокND4LMT-ND4LNuoKNAD4LND5MT-ND5NuoLNAD5антипорт-подібний білокND6MT-ND6NuoJNAD6

Таблиця допоміжних субодиниць Усі мітохондріальні комплекси I мають багато допоміжних субодиниць, які не є необхідними для каталітичної активності та відрізняються в різних видів. Очевидно, що вони піддаються певному функціональному навантаженню, оскільки їхні мутації призводять до спадкових захворювань. Для деяких субодиниць виявлено наявність певних функцій, так B16.6 (GRIM-19) бере участь в апоптозі, а субодиниця 39 кДа (NDUFA9) — у регуляції активності комплексу. Щодо інших субодиниць, то сьогодні активно обговорюється їх можлива роль у регуляції, збірці, стабілізації та захисті від активних форм кисню. Варто зазначити, що допоміжні субодиниці значно збільшують енергетичні витрати клітини на синтез, складання та деградацію комплексу. Такі затрати, тим не менш, можуть окупитись у випадку ядерної клітини, в якій процес синтезу білка добре контролюється. З іншого боку, якщо допоміжні субодиниці є необхідними для стабілізації комплексу I, залишається незрозумілим, яким чином бактеріальні комплекси, які складаються з мінімально потрібної кількості поліпептидів, успішно функціонують без них. На сьогодні вчені не дають чіткої відповіді на ці запитання. Допоміжні субодиниціNo.КороваБілок людиниОписРодина білків PfamСубодиниці1513ANDUFS6бере участь у складанні та стабілізує комплексPF1027616B17.2NDUFA12PF0507117AQDQNDUFS4можливо, фосфорилюється протеїнкіназою А (ПКА), стабілізує комплекс під час складанняPF048001839kDaNDUFA9сполучає мембранний та периферичний домени, бере участь у активації/деактивації комплексуPF0137019ACPMACPMацил-переносний білокPF0055020B8NDUFA2PF0504721MFWENDUFA1цАМФ залежне фосфорилювання ПКАPF1587922B12NDUFB3PF0812223AB13NDUFA5бере участь у активації/деактивації комплексуPF0471624B14NDUFA6PF0534725B14.7NDUFA11PF0246626ESSSNDUFB11цАМФ залежне фосфорилювання протеїнкінази APF1018327PFFDNDUFS5PF1020028B15NDUFB4PF0722529B16.6NDUFA13бере участь в апоптозіPF0621230B18NDUFB7PF0567631PGIVNDUFA8PF0674732B22NDUFB9PF0534733PDSWNDUFB10фосфорилюється Src у ракових клітинахPF1024934ASHINDUFB8PF0582135B14.5BNDUFC2у нормі фосфорильованаPF0637436AGGGNDUFB2PF1481337B14.5ANDUFA7у нормі фосфорильованаPF0734738B9NDUFA3PF1498739MLRQNDUFA4PF0652240SGDHNDUFB5PF0978141MNLLNDUFB1PF0804042KFYINDUFC1у нормі фосфорильованаPF150884342kDNDUFA10PF0171244NDUFA4L2NDUFA4L2PF1588045NDUFV3NDUFV3 -46NDUFB6NDUFB6PF09782Допоміжні білки, що здійснюють збірку47NDUFAF1CIA30фактор складання комплексу 1PF0854748NDUFAF2NDUFAF2фактор складання комплексу 2PF0507149NDUFAF3NDUFAF3фактор складання комплексу 3PF0507150NDUFAF4NDUFAF4фактор складання комплексу 4PF06784 Деякі допоміжні субодиниці фосфорилюються різними кіназами, що ніколи не відбувається з субодиницями кор-ферменту. Побутують здогадки, що таким чином відбувається регуляція роботи комплексу. У вигляді однієї з субодиниць присутній у комплексі ацил-переносний білок (NDUFAB1) із фосфорильованої пантотенової кислоти як простетичної групи. Припускають, що він бере участь у синтезі ліпоєвої кислоти, репарації пошкоджених ліпідів мембрани або ж модифікує інші білки залишками міристинової кислоти. Варто зазначити, що функціонування цього білка не залежить від прямого фізичного контакту з комплексом I і значна його частина присутня у вільному вигляді серед мітохондріального матриксу.

Кофактори

Усі простетичні групи НАДН-дегідрогеназного комплексу (один флавінмононуклеотид і від 8 до 9 залізосіркових кластерів) містяться в периферичному водорозчинному домені. У ссавців, як і у всіх хребетних, їх є вісім. Сім кластерів утворюють електрон-транспортний ланцюг завдовжки ~96 Å від ФМН до місця зв'язування убіхінону. Відштовхуючись від сучасних даних, вважається, що перенесення електрона відбувається по такому шляху: НАДН → ФМН → N3 → N1b → N4 → N5 → N6a → N6b → N2 → Q. Спочатку відбувається передання двох електронів на флавін, а відтак вони один за одним передаються через ланцюжок кластерів до сайту зв'язування хінону та відновлюють його до стану Q−2. Кластер N1a міститься недалеко від флавінового кофактора та не певній відстані від магістрального ланцюга перенесення електронів. Цей кластер є висококонсервативним у різних видів; вважають, що він контролює швидкість транспорту електрона серед комплексу, перекидуючись електроном із ФМН. Існує модель, відповідно до якої один із електронів із флавіну йде магістральним шляхом на хінон, а інший запасається в кластері N1a, а відтак повертається в основний ланцюг через флавосеміхінон. Можливо, такий механізм дає можливість сповільнити утворення активних форм кисню на відновленому флавіні. Тим більше, це сприяє стабілізації (до мілісекунди) стану, за якого кластер N2 відновлений, але немає другого електрона, щоб завершити відновлення убіхінону. Такий стан може бути необхідним для конформаційних змін, спряжених із транспортом протонів.

Частина кластерів із ланцюга (N3, N4 і N6a) мають високий окисно-відновний потенціал (редокс-потенціал) на рівні -0,25 В, у той час як три інших (N1b, N5 і N6b) мають нижчі потенціали. Унаслідок цього редокс-потенціал на шляху електрона міняється за типом американських гірок. Така крива зміни енергетичного стану є характерною для багатьох окисно-відновних ферментів: вона дає змогу оптимізувати швидкість транспорту електрона та домогтися ефективного перенесення енергії.

Кластер N5 має дуже низький потенціал, тому лімітує швидкість загального потоку електронів по всьому ланцюгу. Замість звичайних для залізосіркових центрів лігандів (чотирьох залишків цистеїну), він є скоординований трьома залишками цистеїну та одним залишком гістидину, а також оточений зарядженими полярними залишками, хоч і розташований у глибині ферменту.

Незвичайні ліганди має і термінальний кластер ланцюга — N2. Його редокс-потенціал є найвищим серед усіх кластерів (від -0,1 до -0,15 В). Він зв'язаний із чотирма послідовно розміщеними в поліпептидному ланцюгу залишками цистеїну, що створює напружену конформацію. Через це при його відновленні відбуваються конформаційні зміни сусідніх ланцюгів, можливо, пов'язані з транспортом протона.

Кластер N7 присутній лише в комплексі I деяких бактерій. Він є значно віддалений від решти кластерів і тому не може обмінюватись із ними електронами, тож скоріш за все є реліктом. У деяких бактеріальних комплексах, споріднених із комплексом I, між N7 і рештою кластерів виявили чотири консервативних залишки цистеїну, а в комплексі I бактерії Aquifex aeolicus виявили додатковий Fe4S4 кластер, що з'єднує N7 із рештою кластерів. Із цього випливає висновок, що в A. aeolicus комплекс I, окрім НАДН, може використовувати інші донори електронів, які б передавали останніх через N7.

Збірка мітохондріального комплексу I