Kampania wrześniowa w Polsce stanowiła pierwszy sprawdzian bojowy zarówno Bf 110, jak też opracowanej koncepcji jego użycia. PZL P.11 będące na wyposażeniu polskich eskadr myśliwskich wielokrotnie brały udział w powietrznych pojedynkach z Zerstörerami, będąc od nich zwrotniejsze. Jednak brak silnego uzbrojenia PZL P.11 powodował, iż wiele trafionych i uszkodzonych Bf 110 powracało na lotnisko. Z kolei atutami Bf 110 były prędkość i silne uzbrojenie – efektem trafienia P.11 salwą z 4 karabinów MG 17 i 2 nkm MG FF 20 mm były poważne uszkodzenia struktury płatowca, jego podzespołów, usterzenia oraz zerwanie dużych fragmentów poszycia. Większość z tych samolotów często była porzucana na lotniskach ze względu na rozmiar zniszczeń dokonanych przez ostrzał. W trakcie kampanii wrześniowej piloci PZL P.11 zestrzelili 5 Bf 110C i 2 Bf 110B, a także uszkodzili 4 Bf 110C i 1 Bf 110B. W działaniach w Polsce brał udział m.in. dywizjon I./ZG 1, który stracił dwa samoloty zestrzelone przez myśliwce i przynajmniej jeden przez obronę przeciwlotniczą, ponadto kilka uszkodzonych lub rozbitych, zgłaszając zestrzelenia 7 samolotów polskich. W czasie bitwy o Anglię w drugiej połowie 1940 w pojedynkach z myśliwcami brytyjskimi Supermarine Spitfire i Hawker Hurricane wyraźnie im ustępowały.