Pół roku później, w grudniu 2002 roku, znalazł zatrudnienie w Partizanie Belgrad, po tym, jak władze tego klubu rozwiązały umowę z jednym z najbardziej zasłużonych dla Partizana trenerów, Ljubišą Tumbakoviciem. Matthäus z zespołem, w którego barwach grali wówczas m.in. doświadczeni reprezentanci Jugosławii (Albert Nađ i Saša Ilić) oraz młodzi Danko Lazović i Igor Duljaj, zdobył pierwszy ważny sukces w swojej trenerskiej karierze: mistrzostwo kraju. Osiągnięcie było tym większe, że drużyna zakończyła sezon z aż dziewiętnastoma punktami przewagi nad drugą w tabeli Crveną zvezdą, z bilansem 29–2–3. Ponadto piłkarz Partizana, Zvonimir Vukić, wywalczył koronę króla strzelców ligi.
Do udanych meczów w lidze, doszły także dobre występy w europejskich pucharach. W sierpniu 2003 roku Partizan pokonał po rzutach karnych Newcastle United i awansował do Ligi Mistrzów. Tu jednak trafił na Real Madryt, Olympique Marsylia oraz – prowadzone przez José Mourinho – FC Porto, które ostatecznie wygrało Puchar Mistrzów. Po nieudanej pierwszej fazie rozgrywek grupowych (porażki z Realem i Olympique), tuż po zakończeniu rundy jesiennej w lidze, 13 grudnia 2003 roku Matthäus ogłosił, że odchodzi z klubu. Jako oficjalny powód podał sprawy osobisteGlas: Lotar Mateus podneo ostavku (Dostęp 25 kwietnia 2011)..