Ojciec dał Isabelli większą swobodę w korzystaniu z posagu (40 000 scudi), niż było to wówczas zwyczajem.

W 1562, po śmierci matki, czasowo wypełniała obowiązki pierwszej damy Florencji, wykazując umiejętności polityczne. Sprowadzała do Florencji grupy śpiewacze specjalizujące się w mandrygałach.

Rzadko widziała się z mężem. Kilka razy poroniła. Córkę Francescę Eleonorę (znaną jako Nora) urodziła w 1571, a syna Virginio w 1572. Dzieci, szczególnie po śmierci ojca Isabelli, stały się osią jej konfliktu z mężem.

Świadoma zagrożenia ze strony męża, prosiła Katarzynę Medycejską o azyl we Francji. Zmarła niespodziewanie w willi Medyceuszy w Cerreto Guidi. Większość historyków zakłada, że ​​została uduszona przez męża w odwecie za romans z jego kuzynem, Troilo Orsini. Romans rzeczywiście miał miejsce. Sam Paolo Giordano spotykał się wówczas w Rzymie z zamężną Vittorią Accoramboni, której męża również planował zabić, by ożenić się z Vittorią. Możliwe, że Paolo Giordano działał na polecenie Wielkiego Księcia Toskanii Francesco, brata Izabeli.