Śmierć thumb|Ojciec Pio i premier Włoch Aldo Moro thumb|Ciało ojca Pio spoczywa obecnie w zamkniętej srebrnej trumnie w krypcie w San Giovanni Rotondo W ostatnich tygodniach życia nadal starał się codziennie odprawiać mszę, a następnie medytować w celi zakonnej. 22 września po mszy, pozdrowił wiernych przed placem kościelnym, a następnie został przeniesiony do celi, gdyż nie miał już sił poruszać się o własnych siłach. Wyspowiadał się, odnowił śluby zakonne i przyjął sakrament namaszczenia chorych. Zmarł o 2:30 (23 września) wypowiadając ostatnim tchnieniem słowo „Maryja”. Uroczystości pogrzebowe odbyły się 26 września, a jego ciało zostało pochowane w krypcie pod kościołem w San Giovanni Rotondo.
Cierpienia duchowe Ojciec Pio wierzył, że miłość Boga była nierozerwalnie związana z cierpieniem i że przyjmowanie wszystkich cierpień ze względu na Boga jest drogą duszy do osiągnięcia jedności z Nim. Uważał, że jego dusza jest zagubiona w chaotycznym labiryncie i pogrążona w całkowitej pustce, jak gdyby był w najgłębszej otchłani piekła. W czasie jego cierpień duchowych jego zwolennicy wierzyli, że ojciec Pio był atakowany, zarówno fizycznie, jak i duchowo, przez diabła. Diabeł miał mu się ukazywać jako „anioł światłości”, by go zwieść oraz wielokrotnie niszczyć jego korespondencję z przewodnikami duchowymi.