1 września 1939 r. awansował na stopień admirała i został głównym dowódcą japońskiej Połączonej Floty. W 1941 r. opracował zlecony mu plan wyparcia USA z regionu Pacyfiku, choć był przeciwny wojnie ze Stanami Zjednoczonymi, uważał bowiem, że przewaga amerykańskiego potencjału gospodarczego uniemożliwia Japonii zwycięstwo. W ramach tego projektu opracował plan ataku na Pearl Harbor, który wzorował na brytyjskim rajdzie na włoski port w Tarencie z 1940 roku.
W 1942 r. parł wbrew opinii innych oficerów sztabu do walnej bitwy z amerykańską flotą, która w jego ocenie miała szanse zakończyć się całkowitym rozbiciem sił amerykańskich. Ostatecznie stoczona w rzeczywistości bitwa pod Midway stała się pierwszą porażką japońskiej floty, a Yamamoto został zmuszony do zakończenia operacji.