Pozostając pod wpływem Paula Ehrlicha, sprawdzał bakteriobójcze własności nowych barwników, otrzymywanych przez naukowców pracujących w zakładach w Eberfeld.
W 1935 ogłosił, że prontosil, czerwonopomarańczowy barwnik z grupy sulfonamidów, skutecznie zwalcza infekcje powodowane przez bakterie zwane paciorkowcami. Tym samym po raz pierwszy stwierdzono, że jakiś środek chemiczny może działać in vivo na powszechnie występujące bakterie chorobotwórcze. Barwniki badane wcześniej działały jedynie na znacznie większe od bakterii pierwotniaki.
To odkrycie zapoczątkowało stosowanie sulfonamidów w lecznictwie i zainspirowało wielu naukowców do pracy nad nowymi lekami z tej grupy. Nawet odkrywca penicyliny, Alexander Fleming porzucił wtedy badania nad swoim antybiotykiem na rzecz prontosilu. Najważniejszych ustaleń dokonał jednak Daniel Bovet wraz z zespołem. Protonsil i inne leki z grupy sulfonamidów ocaliły życie wielu ludziom – m.in. Franklinowi D. Rooseveltowi, Winstonowi Churchillowi oraz córce samego Domagka.