Zasługą Sykstusa było wydanie dobrego tekstu Septuaginty. Nad tzw. Wulgatą sykstyńską pracował przez osiemnaście miesięcy. Po ukończeniu prac, w kwietniu 1590 r., wydał bullę „Aeternus Ille”, w której ogłosił Wulgatę swojego autorstwa jedynym prawowitym tłumaczeniem tekstu Pisma Świętego, a wszelkich prób ingerencji w jego treść bądź wydania Biblii, w języku innym niż łacina zabronił pod groźbą ekskomuniki. Zasugerował również, że wszystkie wydania odbiegające swoją treścią od jedynego „prawdziwego, obowiązującego, autentycznego i nie kwestionowanego” przekładu powinny zostać zniszczone. Jako że Sykstus podczas prac nad swoim dziełem kierował się własną wyobraźnią, w twórczym zapędzie pozmieniał układ rozdziałów i numerację wersów, a czasem nawet pomijał całe wersy, o ile nie pasowały do jego wizji. Stworzona w ten sposób Wulgata nie zyskała uznania kardynałów, którzy po śmierci autora wstrzymali jej druk i rozpoczęli akcję masowego odkupywania już sprzedanych egzemplarzy – rzekomo na mocy ostatniej woli Sykstusa V – by je następnie zniszczyć.