Trzeci okres działalności (od 1789 do 1794) Od roku 1789 rozpoczął się stopniowy rozkład i utrata wpływów Komisji, co było procesem równoległym do powolnej utraty wpływów politycznych przez stronnictwo reformatorów i rozpadu Rzeczypospolitej. W czasie obrad Sejmu Czteroletniego frakcja reformatorów zgodziła się na daleko idące ustępstwa w sprawach szkolnictwa, aby móc przeforsować Konstytucję 3 maja. Konstytucja ta czyniła prezesem KEN prymasa Polski, który zasiadał w Straży Praw jako swoisty minister oświaty.
Ostateczny cios Komisji zadała konfederacja targowicka, która odebrała jej władzę nad szkołami zakonnymi oraz całkowicie zmieniła jej skład. Wielu członków Komisji (z Kołłątajem na czele) i tak musiało opuścić kraj po zwycięstwie Targowicy, gdyż wydano na nich zaoczne wyroki śmierci w związku z ich ogólną działalnością politycznąWładysław Smoleński Konfederacya targowicka Kraków 1903 s.274.
Istnienie Komisji Edukacji Narodowej potwierdził i określił jej kompetencje sejm grodzieński (1793)Volumina Legum, t. X, Poznań 1852, s.