Historia mały|Port w Guayaquil na obrazie Ernesta Chartona z 1846 roku Guayaquil powstawało etapami: miasto kilkakrotnie próbowano lokować, przenoszono je i osadzano na nowo. Oficjalny akt fundacyjny, przyjmowany przez władze miejskie i archiwum , datowany jest na 15 sierpnia 1534 roku, a większość historyków przypisuje go marszałkowi Diegowi de Almagro. Ostatecznie miasto ulokowano w obecnym miejscu, na zboczach wzgórza , w 1547 roku pod nazwą Santiago de Guayaquil. Nazwa miasta pochodzi od formy : tak w dokumentach kolonialnych wielokrotnie zapisywano imię miejscowego kacyka, nazwę rządzonej przez niego osady i nazwę rzeki. Rozpowszechniona wersja, która wywodzi nazwę miasta od imion kacyka Guayasa i księżniczki Quil, uchodzi za legendę. W epoce kolonialnej Guayaquil stało się ważną stocznią i portem handlowym w służbie Korony Hiszpańskiej oraz jednym z głównych ośrodków morskich na pacyficznym wybrzeżu Ameryki. Miasto uczestniczyło także w handlu transpacyficznym związanym z .