W tym 1557 roku ufundował w Wilnie pierwszy na Litwie zbór i szkołę wyznania reformowanego. Wkrótce zaczął energicznie zwalczać katolicyzm i prawosławie w swoich litewskich i małopolskich posiadłościach: do 1560 odebrał katolikom kościoły w Nieświeżu, Klecku, Ołyce, Subotnikach, Mordach i Szydłowcu i przekazał je pastorom kalwińskim. Zaczął też aktywnie propagować protestantyzm, otwierając drukarnie w Nieświeżu i Brześciu, gdzie w 1563 wydrukowano Biblię brzeską, zwaną też Radziwiłłowską – pierwsze tłumaczenie całego Pisma Świętego na język polski z języków oryginalnych (Mikołaj Czarny finansował zarówno prace zespołu tłumaczącego Biblię w Pińczowie, jak i wydanie jej w Brześciu). Wspierał również działaczy reformacji, takich jak Francesco Stancaro, Szymon Budny, Marcin Czechowic i Jan Łaski.
Poparcie braci polskich Na początku lat 60. XVI wieku w łonie polskiego Zboru Reformowanego nastąpił spór dotyczący nauki o Trójcy Świętej. Początkowo Mikołaj Czarny poparł stronę trynitarian, wygnał nawet Szymona Budnego, którego sobór kalwiński uznał za winnego odrzucenia doktryny Trójcy.