Mikroskopia dwufotonowa – jedna z odmian mikroskopii fluorescencyjnej pozwalająca na obrazowanie próbek o grubości do 1 milimetra. Mikroskopia dwufotonowa może być też alternatywą dla mikroskopii konfokalnej z powodu lepszej penetracji próbki i zmniejszonej fototoksyczności.
Mikroskopia dwufotonowa wykorzystuje pomysł opisany przez Marię Göppert-Mayer w jej pracy doktorskiej w 1931 roku. Idea tej techniki opiera się na fakcie, że dwa fotony o mniejszej energii, spotykające się w tym samym czasie w pobliżu fluoroforu mogą go wzbudzić i wywołać jego fluoroscencję. Każdy z tych fotonów padający osobno na fluorofor, nie wywołałby emisji, z powodu zbyt niskiej energii wzbudzenia. Jakkolwiek prawdopodobieństwo jednoczesnego zaabsorbowania dwóch fotonów jest niezwykle niskie, stąd by wzbudzić fluorofor, potrzebny jest ich gęsty strumień. W praktyce mikroskopię dwufotonową zastosował Winfried Denk w Cornell University. Dodatkowo połączył on pomysł dwufotonowości ze skanerem laserowym.
thumb|350px|Schemat zasady działania mikroskopii dwufotonowej