W mikroskopii dwufotonowej wykorzystuje się laser podczerwony, który zostaje zogniskowany przez soczewki obiektywu. Zazwyczaj jest to femtosekundowy laser na szafirze domieszkowanym tytanem, pulsujący w trybie ~100 femtosekundowym i częstotliwością ~80 MHz, co pozwala na uzyskanie strumienia fotonów o dużej gęstości, potrzebnej do wzbudzenia fluoroforu. Technologia dwufotonowa jest opatentowana przez Winfrieda Denka, Jamesa Stricklera i Watta Webba z Cornell University.
Najczęściej używane fluorofory mają widma wzbudzenia w zakresie 400-500 nm, gdy laser w mikroskopii dwufotonowej ma zakres 700–1000 nm (podczerwień). Jeśli fluorofor zaabsorbuje jednocześnie dwa takie fotony o obniżonej energii, dostanie jej wystarczająco, by zostać wzbudzonym do wyższego stanu energetycznego. Wracając do stanu podstawowego, wyemituje już pojedynczy foton o odpowiedniej energii, zależnie od typu fluoroforu (zwykle w zakresie widzialnym).