Prawdopodobieństwo wzbudzenia fluoroforu przez dwa różne fotony jest niskie i zależne od kwadratu natężenia wiązki wzbudzającej. Jednak zapewnia to, że wzbudzenie nastąpi tylko w punkcie ogniskowania wiązek. Za pomocą zwierciadła skanującego można przesuwać punkt ogniskowania po płaszczyźnie ogniskowania i w ten sposób skanować daną płaszczyznę próbki. Przesuwając punkt ogniskowania w górę i w dół, możemy także skanować trzeci wymiar. Dużą zaletą systemu dwufotonowego jest to, że używane do wzbudzania światło podczerwone nie ulega rozpraszaniu tak silnie jak krótsze fale, co podnosi rozdzielczość obrazowania. Ponadto ma ono lepszą zdolność do penetracji próbki (z drugiej strony fale dłuższe niż 1400 nm są z kolei bardzo silnie pochłaniane przez wodę obecną w preparatach). Dłuższa fala niesie także mniej energii, co obniża możliwe uszkodzenia powodowane przez światło poza płaszczyzną ogniskowania, przy przechodzeniu przez próbkę (fototoksyczność). Wadami systemu jest ich wysoka cena, na którą wpływa konieczność stosowania drogiego lasera podczerwonego i dostosowanej do niego optyki. Także widma absorpcji fluoroforów w systemie dwufotonowym różnią się od tych w systemie jednofotonowym, co często pociąga za sobą konieczność stosowania niestandardowych rozwiązań w tej kwestii.
Bibliografia
Dwufotonowy