W kwestiach ontologicznych Diderot nie wypracował jednolitego stanowiska. Nie uznawał materii za jednorodną, uniwersalną substancję, leżącą u podstaw wszystkich zjawisk. Z licznych jego tekstów wynika, że zbliżał się do monistycznego materializmu (wszystko składa się z materii), zarazem jednak uznawał, że nie ma czegoś takiego jak abstrakcyjna materia, ale że istnieją jej różne formy w konkretnych zjawiskach, lub (w niektórych tekstach), że istnieją „materie”.

W biologii był zwolennikiem witalizmu, wskazywał jednak na znacznie większą rolę chemii w wyjaśnianiu życia, aniżeli tacy witaliści jak Théophile Bordeu. Działania organizmu nie da się jednak wyjaśnić wyłącznie w kategoriach mechanicznych czy chemicznych. Jest on połączeniem tych czynników, zyskujących własną specyfikę poprzez wysoki poziom organizacji. Jest również uznawany za jednego z prekursorów ewolucjonizmu. Natura jest w ciągłym ruchu i w ciągłym procesie stopniowych przemian. Nie istnieją jej stałe i określone wcześniej jej formy (np. biologiczne gatunki), lecz istnieje między nimi ciągłość.