Po hołdzie pruskim Królewiec stał się jednym z głównych ośrodków polskiego protestantyzmu i prężnym ośrodkiem polskiego drukarstwa. Wydawano tu polską literaturę religijną, w tym tzw. Biblię Królewiecką (pierwszy drukowany przekład Nowego Testamentu na język polski) oraz jedne z najstarszych polskich elementarzy. Po nadaniu w 1560 roku przez króla Polski Zygmunta II Augusta przywilejów Uniwersytetowi Albrechta (założonemu jako drugi uniwersytet w Rzeczypospolitej po Akademii Krakowskiej), Królewiec stał się także jednym z wiodących polskich ośrodków uniwersyteckich. Polacy zamieszkiwali głównie Królewiec oraz współczesny przygraniczny pas południowy obwodu., który nawet początkowo po II wojnie światowej przyznany został Polsce, jednakże ostatecznie został wcielony do ZSRR. Względem Polaków prowadzono politykę germanizacji, zaostrzoną zwłaszcza po rozbiorach Polski.
We wschodniej części regionu, nazywanej Małą Litwą, zamieszkiwali Litwini pruscy. Region był ważnym ośrodkiem kultury litewskiej, gdy pozostałe etnicznie litewskie ziemie znajdowały się w zaborze rosyjskim. Stąd litewscy kolporterzy książek przemycali litewskojęzyczne książki do zaboru rosyjskiego.