Opis Analiza filologiczna przeprowadzona przez A.A. Aleksiejewa wykazała, iż przekład Biblii ostrogskiej bazował na rękopisie Biblii Gennadiusza ukończonym w roku 1499. Przekład został skonfrontowany z greckim tekstem Septuaginty (wydanie Aldina, Wenecja 1518), łacińską Wulgatą, czeską Biblią Melantricha, białoruską Biblią Franciszka Skaryny oraz przekładem Psałterza Maksyma Greka. Ten ostatni przekład stanowił dla redaktorów Biblii ostrogskiej wzór zgodności z tekstem greckim.
Druk rozpoczęto w 1580 roku a zakończono w sierpniu 1581. Zachowane egzemplarze mają dwie różne daty zakończenia prac: najczęściej jest to 12 sierpnia 1581, lecz niektóre posiadają datę 12 lipiec 1580. Opóźnienia w druku wynikały z problemów w tłumaczeniu przede wszystkim Starego Testamentu jednocześnie przyczyniło się to do kilkakrotnego zwiększania nakładu już w trakcie druku. W tekście zauważalne są pewne różnice tekstowe pomiędzy egzemplarzami z 1580 a 1581 roku. Nakład szacuje się na 1000–1500 egzemplarzy.
W księdze została umieszczona przedmowa Konstantego Wasyla Ostrogskiego.