Fluorofory muszą zostać wzbudzone światłem o określonej długości fali, a wyemitowana przez nie energia musi być wykryta i zmierzona. Do wzbudzania fluoroforów używa się lampy, diody elektroluminescencyjnej lub lasera. Lampy emitują światło o szerokim zakresie długości fal, podczas gdy LED i laser – wąskie. Detektory mogą posiadać filtry, dzięki którym wykrywana i mierzona jest tylko jedna długość fali.
Ilościowy PCR pozwala również obliczyć początkową liczbę kopii badanego fragmentu DNA, jaka była obecna w próbce przed reakcją. W tym celu wykorzystuje się moment, w którym poziom fluorescencji barwnika przekroczy próg nazywany cyklem granicznym (Ct, z ang. treshold cycle) lub cyklem kwantyfikacji (Cq, z ang. quantification cycle). Im wcześniej poziom fluorescencji wzrósł do poziomu, który umożliwia wiarygodny odczyt, tym większa była początkowa liczba kopii badanej sekwencji w próbce na początku reakcji. Ct (Cq) jest momentem wejścia reakcji w fazę logarytmicznego przyrostu ilości produktu.