Po I wojnie światowej funkcjonowanie seminarium wyglądało podobnie jak u schyłku XIX wieku. W latach 1927–1939 dokonano znacznej rozbudowy budynku, przez dobudowanie drugiego i trzeciego piętra oraz skrzydeł. W roku rozpoczęcia II wojny światowej archidiecezja gnieźnieńska i archidiecezja poznańska posiadały dwa wspólne zakłady teologiczne w Gnieźnie i Poznaniu. W 1938 roku poczet alumnów wynosił w Gnieźnie 66 osób. Ostatnim przedwojennym rektorem był bł. Michał Kozal, późniejszy biskup włocławski. W latach 1940–1945 w seminarium w Gnieźnie nie prowadzono formacji dla przyszłych księży. Zajęty przez Niemców gmach uczelni służył początkowo jako szpital wojskowy, a następnie, przejęty przez Schutzpolizei, jako pierwsza w Kraju Warty szkoła policyjna dla volksdeutschów. Tu po przyśpieszonym czteromiesięcznym kursie wychodzili komendanci posterunków policyjnych. Cały gmach został przebudowany na wzór niemieckich koszar, przez co zniszczono zabytkowe elementy wnętrz. Do budowy placu ćwiczeń używany był gruz ze zburzonej w pierwszym tygodniu okupacji synagogi żydowskiej. Cały księgozbiór natomiast wywieziono do kościoła św. Michała w Poznaniu.