Podczas okresu reformacji w Europie Amsterdam pozostawał miastem katolickim, jednak w końcu i tu zwyciężył protestantyzm. W 1535 r. miały miejsce w Amsterdamie krwawo stłumione demonstracje na rzecz równości religii. Rada miejska, która przez długi czas tolerowała protesty mieszkańców, została zastąpiona znacznie surowsza władzą. Mimo poparcia amsterdamczyków wydarzeń z 1566 r. (rewolta ikonoklastów), to już na początku wojny osiemdziesięcioletniej w Niderlandach przeciw Filipowi II Amsterdam stanął po stronie katolickiego króla Hiszpanii. Po zwycięstwie w bitwie o Haarlem, które Hiszpanie zawdzięczali w dużej mierze pomocy mieszkańców Amsterdamu, przyszła dotkliwa porażka w 1578 r. Po klęsce wojsk hiszpańskich Amsterdam zawarł przymierze z innymi miastami Niderlandów, stając w walce po stronie księcia Wilhelma Orańskiego. Wkrótce w mieście zapanowały rządy protestantów i sprzymierzeńców Wilhelma. Po zajęciu Antwerpii przez Hiszpanię w 1585 r., w Amsterdamie azyl znalazło wielu uciekinierów z zajętego miasta, którzy zaczęli odbudowywać swoje majątki. Równie dobry wpływ na zamożność miasta mieli bogaci Żydzi, którzy przybywali z Portugalii i Hiszpanii, gdzie byli prześladowani. Pod koniec XVI wieku z Amsterdamu wypływały pierwsze statki do Indii.