Zaskarżyła powołującą ją uchwałę do Trybunału Konstytucyjnego, który w wydanym orzeczeniu uchylił znaczną część jej zapisów jako sprzecznych z ustawą zasadniczą. W maju 2006 Donald Tusk ponownie został wybrany na szefa partii, pokonując na kongresie w głosowaniu Andrzeja Machowskiego stosunkiem głosów 533:97.
Rozkład sił w parlamencie skłaniał liderów PO do nawiązania współpracy z Polskim Stronnictwem Ludowym. Wyrazem tego było utworzenie bloków właśnie z tą partią w większości województw podczas wyborów samorządowych w 2006. Ich rezultaty były dla PO korzystne. Partia zdobyła najwięcej mandatów w sejmikach województw (186 na 561) (uzyskawszy w skali kraju 27,3%). Wyniki te pozwoliły po pewnych zmianach ostatecznie na współrządzenie w 15 województwach. Udało się także zdobyć m.in. urząd prezydenta Warszawy dla Hanny Gronkiewicz-Waltz, która w drugiej turze pokonała kandydata PiS, byłego premiera Kazimierza Marcinkiewicza (była prezes NBP, działająca w PO od 2005, komisarycznie zarządzała stołecznymi strukturami, które znajdowały się w kryzysie po okresie rządów Pawła Piskorskiego, w kwietniu 2006 wykluczonego z partii w związku z oskarżeniami o nadużycia, których miał się dopuszczać w swojej działalności biznesowej).