Zmagania olimpijskie rozpoczęto tuż przed godziną 14:00 czasu lokalnego. Papadiamandopulos, grecki pułkownik albo major, wygłosił krótkie przemówienie patriotyczne, które Sokratis Lagudakis, student medycyny mówiący po francusku (i zarazem uczestnik biegu), skwitował zagranicznym uczestnikom w takich słowach: Jeśli któryś z was wygra, będziecie dla nas jak bracia. Chwilę później Papadiamandopulos dał sygnał do startu za pomocą strzału z pistoletu. Zawodnicy wystartowali z mostu w miejscowości Maraton, zaś meta zlokalizowana była na stadionie Panathinaiko w Atenach. Długość biegu nie była tożsama z długością współczesnych biegów maratońskich, liczyła bowiem około 40 kilometrów. Po raz pierwszy na dystansie 42 km 195 m biegano na londyńskich igrzyskach w 1908 roku i od Letnich Igrzysk Olimpijskich 1924 maratony olimpijskie rozgrywa się na tym dystansie.
Charalambos Anninos (1896) pisał, że zawodnicy przed startem byli ustawieni w dwóch rzędach. Nieznany z imienia reporter zanotował jednak, że sportowcy byli rozstawieni w czterech rzędach. Za tą wersją opowiadają się m.in. Anthony Bijkerk i David Young.