Największym problemem dla Justyniana był monofizytyzm, gdyż współpraca z Rzymem prowadziła do konieczności opowiedzenia się przeciw heretykom. Z kolei utrzymanie jedności na wschodzie wymagało współpracowania z monofizytami. Usiłował doprowadzić do kompromisu, który zadowalał by obie strony. Dzięki wpływowi Teodory, zaprosił do Konstantynopola jednego z najbardziej wpływowych monofizytów – Sewera z Antiochii. Następnie zezwolił na powrót wygnanych biskupów monofizyckich, a kiedy powstał wakat na tronie Patriarchy Konstantynopola, Justynian powołał na tę funkcję Antyma I. W 533 roku opracował „Nowy Henotikon”, w którym pomija problem natury Chrystusa, by umożliwić kompromis między chalcedonianami i monofizytami. Zarówno Jan II jak i Epifaniusz zaakceptowali tekst, jednak wkrótce okazało się, że stronnictwo nie doszły do porozumienia. W 536 roku Agapit nakłonił cesarza do zaostrzenia kursu względem monofizytów, co skończyło się wypędzeniem Sewera i Antyma. Pomimo wdrożenia edyktów antymonofizyckich, wielu biskupów uniknęło prześladowań, dzięki protekcji Teodory.