Madonna jest umieszczona między św. Sykstusem i św. Barbarą. Oboje świętych pełnią funkcję pośredników między mieszkańcami nieba a wiernymi na ziemi. Choć św. Sykstus jest zwrócony ku Marii, prawą rękę wyciąga ku widzom. Święty ma rysy twarzy zleceniodawcy obrazu, papieża Juliusza II. Znajdująca się w lewym dolnym rogu obrazu tiara papieska jest jedynym punktem stałym. Św. Barbara ma na sobie ubrania modne na renesansowym dworze. Przyklękająca św. Barbara patrzy w dół, nawiązując duchową relację z wiernymi, którzy mogli oglądać obraz z dołu. Św. Barbara stanowi portret jednej z krewnych Juliusza II. Wśród osób, które mogły zostać uwiecznione na obrazie, wymieniane są m.in. siostrzenica papieża Julia Orsini lub też bratanica Lukrecja della Rovere.
Na samym dole Rafael umieścił dwa putta ze skrzydłami, które poważnie wznoszą oczy ku niebu, przejęci świętością nieba. Ich wzrok jest w źródłach opisywany również jako nieco znudzony. Anioły stanowią symbol niedojrzałej duszy ludzkiej.