Okres uniwersytecki Po ukończeniu gimnazjum wstąpił w 1859 na wydział nauk przyrodniczych Uniwersytetu Charkowskiego. Latem 1860, z powodu pogarszających się warunków życia na wsi, rodzina Łysenki przenosi się do Kijowa. Mykoła zaczyna studiować na wydziale przyrodniczym Uniwersytet Kijowski. W Kijowie wszędzie towarzyszy mu kuzyn i nieodłączny przyjaciel Mychajło Starycki.
W środowisku studenckim panowała atmosfera ukraińskiego patriotyzmu. Łysenko i Starycki szybko zbliżyli się do studentów, którzy stali się w przyszłości aktywnymi ukraińskimi działaczami kulturalnymi i społecznymi – Mychajła Drahomanowa, Tadeja Rylskiego, Wołodymyra Antonowycza i innych. Łysenko zachłysnął się działalnością narodową i brał udział w pracach kilku stowarzyszeń ukraińskiej inteligencji, w tym również Starej Hromady.