W 1931 został jednym ze współzałożycieli kolektywu artystycznego Group Theatre, z którym związani byli m.in.: Elia Kazan, John Garfield, Stella Adler, Sanford Meisner, Franchot Tone i Robert Lewis. W 1949 rozpoczął karierę wykładowcy w nowojorskiej szkole „Actors Studio”. W ciągu dwóch lat, gdy był tam dyrektorem artystycznym, zbudował od podstaw jej reputację i renomę. Wśród aktorów pobierających nauki w „Actors Studio” byli m.in.: Marlon Brando, Geraldine Page, Paul Newman, Al Pacino, Kim Stanley, Marilyn Monroe, Jane Fonda, James Dean, Dustin Hoffman, Eli Wallach, Eva Marie Saint, Robert De Niro, Jill Clayburgh, Burt Young, Ellen Burstyn, Gene Wilder, Steve McQueen i Dennis Hopper.
W 1966 utworzył „Actors Studio West” w Los Angeles. W 1969 powstał „Lee Strasberg Theatre and Film Institute” w Nowym Jorku i Los Angeles.
Sam rzadko występował jako aktor (pojawił się jedynie w kilku filmach). Jego najbardziej znana rola to Hyman Roth w filmie Ojciec chrzestny II (1974) Francisa Forda Coppoli. Strasberg za tę kreację był nominowany do Oscara dla najlepszego aktora drugoplanowego. Ostatecznie nagrodę otrzymał wówczas Robert De Niro, czyli jeden z jego uczniów. Później zagrał jeszcze m.in.