Według starochrześcijańskiej tradycji Łukasz poznał Pawła w Troadzie podczas jego drugiej podróży misyjnej (Dz.Ap. 16,6–15). Po raz drugi przyłączył się do niego w roku 57 (Dz.Ap. 20,1–15). Odtąd miał mu towarzyszyć aż do uwięzienia w Rzymie (II Tym. 4, 11). Wedle Euzebiusza (Historia kościelna III,94) Łukasz był z pochodzenia Grekiem z Antiochii, z zawodu lekarzem. Według Epifaniusza (C. Jul. Orat. 4,69) po śmierci Pawła Łukasz podjął pracę misyjną w Dalmacji, Galii, Italii i Macedonii. Kościół czci go jako męczennika.

Głównym argumentem przemawiającym za słusznością utożsamienia autora Trzeciej Ewangelii i Dziejów Apostolskich z Łukaszem, towarzyszem Pawła, są cztery fragmenty w Dziejach Apostolskich, w biblistyce niemieckiej zwane „Wirstücke”, zaś w anglosaskiej „we-passages” – są to kolejno: Dz.Ap. 16,10–17; 20,5–15; 21,1–18; rozdziały 27 i 28. W tych czterech fragmentach narrator przemawia w pierwszej osobie liczby mnogiej, co sugeruje, że podróżował wraz z apostołem Pawłem. Uczeni nie są zgodni w ocenie tego argumentu;