Przez pewien czas był spowiednikiem gubernatora Mediolanu markiza Alfonsa d’Avalos. W 1539 był przejściowo przypisany do konwentu S. Secondo w Wenecji. W październiku 1542 został mianowany wikariuszem trybunału inkwizycyjnego w Pawii.
W 1550 kapituła lombardzkiej prowincji dominikanów mianowała go inkwizytorem diecezji Como. Jego niezłomna postawa w sporze z miejscową kapitułą katedralną, którą podejrzewał o sprzyjanie reformacji, zwróciła uwagę kardynała Gian Pietro Carafy, inkwizytora generalnego Rzymskiej Inkwizycji, który zaczął wykorzystywać Ghislieriego jako delegata Rzymskiej Inkwizycji do poszczególnych zadań. W listopadzie i grudniu 1550 i ponownie w kwietniu i maju 1551 Ghislieri działał z ramienia Inkwizycji Rzymskiej w Bergamo, gdzie zebrał dowody mocno obciążające miejscowego biskupa Vittore Soranzo i doprowadził do jego aresztowania. W marcu 1551 przebywał z kolei w Ferrarze, gdzie przesłuchiwał i ostatecznie skazał na śmierć Giorgio Rioli, zwanego il Siculo, jednego z najbardziej znanych przedstawicieli włoskiej reformacji.