3 czerwca 1551 papież Juliusz III mianował go komisarzem generalnym Inkwizycji Rzymskiej (sprawował tę funkcję do 1557).
4 września 1556 Carafa, już jako papież Paweł IV, mianował Ghislieriego biskupem Nepi i Sutri (konsekracja 14 września 1556), a w marcu 1557 kardynałem, z tytułem Santa Maria sopra Minerva. W grudniu 1558 Ghislieri otrzymał także godność najwyższego inkwizytora. Papież Pius IV przeniósł go w marcu 1560 na stolicę biskupią Mondovi. Stosunki Ghislieriego z Piusem IV nie układały się najlepiej, kardynał m.in. sprzeciwiał się nominacji kardynalskiej dla 13-letniego Ferdynanda Medyceusza. Mimo to w 1564 uzyskał potwierdzenie swej pozycji jako zwierzchnika Świętego Oficjum.
Pontyfikat Po śmierci Piusa IV, konklawe 1565–1566 wybrało kardynała Ghislieriego na papieża 7 stycznia 1566. Przyjął on imię Piusa V i został koronowany w dniu swoich urodzin, 17 stycznia 1566. Swój wybór, Pius mógł zawdzięczać liderowi reformatorskiej frakcji kardynałów, na czele z Karolem Boromeuszem. Papież-asceta, wieloletni inkwizytor, poświęcił swój pontyfikat zadaniom reformy Kościoła w duchu soboru trydenckiego. Zamierzał wprowadzić w Watykanie rygory klasztorne.