W 1527 roku król Zygmunt I Stary potwierdził w Krakowie sprzedaż dóbr Siemiatycze Bohuszowi Bohowitynowiczowi (zm. 1546) (dokument sprzedaży tenże król potwierdził w Brześciu 30 sierpnia 1543 r.).
W 1541 roku król Zygmunt II August (1548–1572) - na prośbę dziedziców Siemiatycz i Kraśnika – Stanisława Tęczyńskiego (1514–1560), starosty lubelskiego (1547–1560) i jego żony (od ok. 1538) Anny z Bohowitynowiczów (zm. 17.04.1565) - w 1542 roku wydał przywilej na lokację miasta na prawie magdeburskim, a w dniu 8 marca 1544 roku pozwolił Stanisławowi Tęczyńskiemu z Tęczyna, kasztelanowi lwowskiemu, pobudować most na Bugu k. Siemiatycz i pobierać mostowe. W dniu 5 listopada 1546 roku król Zygmunt II przyłączył dobra siemiatyckie do ziemi drohickiej.
Od XVI do XVIII wieku miasto było własnością: Tęczyńskich (1497), Szydłowieckich (1502), Bohowitynowiczów (1527), Tęczyńskich (1538), Olelkowiczów (1558), Radziwiłłów (1578), Sapiehów (od 1599) i Jabłonowskich (1750). Dziedzice Siemiatycz sprawowali patronat nad majątkiem kościelnym. Za czasów Olelkowiczów (ok. 1566) kościół w Siemiatyczach został zamieniony na zbór protestancki. Jego rekoncyliacji w dniu 3 listopada 1618 roku dokonał ks. Andrzej Lipski (1572–1631), biskup łucki (1617–1623). XVII wiek Budowę obecnej, murowanej świątyni pw.