Zastosowanie operacyjne Po wybuchu II wojny światowej trzy pierwsze okręty podwodne typu U rozpoczęły działania bojowe na Morzu Północnym, w pobliżu niemieckich wybrzeży. Trudne warunki nawigacyjne i silne przeciwdziałanie ze strony niemieckich sił ZOP sprawiło, że jednostki te nie odniosły zbyt dużych sukcesów. 6 stycznia 1940 roku prototypowy HMS „Undine” został zmuszony do wynurzenia przez niemieckie trałowce „M 1201”' „M 1204” i „M 1207” i zatopiony w rejonie wyspy Helgoland przez własną załogę, która dostała się do niewoli. Pomimo to okręty typu U działały na wodach Morza Północnego i Zatoki Biskajskiej do końca wojny, dezorganizując niemiecką żeglugę w tych rejonach.
Wraz z wchodzeniem do służby w Royal Navy kolejnych jednostek, część okrętów została od 1941 roku przebazowana na Morze Śródziemne, działając z bazy na Malcie, gdzie stanowiły podstawę 10. Flotylli Okrętów Podwodnych. W jej ramach, jednostki U działały ze zmiennym szczęściem. Poniosły całkowitą klęskę w operacjach przeciwko niemieckim transportom przewożącym do Afryki oddziały Afrika Korps generała Erwina Rommela, zatapiając jedynie 6 ze 100 transportowców. W lutym i marcu 1941 roku okręty typu U zatopiły jedynie 20 000 z 220 000 ton zaopatrzenia Osi kierowanego do Libii.