W 1588 roku „Ark Royal”, jako największy z angielskich galeonów nowego typu, został flagowym okrętem angielskiej floty pod dowództwem admirała Charlesa Howarda i wziął udział w walkach przeciwko Wielkiej Armadzie. Przez cały okres walk „Ark Royal” był wyróżniającym się okrętem, pod Plymouth 31 lipca jako pierwszy zaatakował hiszpańską karakę „La Rata Santa Maria Encoronada”, którą Anglicy błędnie zidentyfikowali jako okręt flagowy Armady. Pod Portland Bill 2 sierpnia „Ark Royal” pierwszy raz zmierzył się z flagowym galeonem księcia Medina-Sidonia „San Martin”, ostrzeliwując przeciwnika z dystansu, i mimo kilkakrotnych prób abordażu uniknął ich dzięki sprawnemu manewrowaniu. W pewnym momencie bitwy hiszpański okręt opuścił nawet marsle, zachęcając Anglików do podpłynięcia bliżej i rozegrania bitwy na pokładach, ale admirał Howard zignorował ten rycerski gest, mając na uwadze angielską taktykę morską, która kładła nacisk na manewrowanie okrętem i salwy burtowe artylerii. W bitwie pod Gravelines 8 sierpnia „Ark Royal” początkowo starł się z osadzonym na mieliźnie galeasem „San Lorenzo”, później walczył z hiszpańskimi galeonami osłaniającymi centrum Armady.