Druga połowa XV i XVI wiek, mimo pożaru kościoła w 1527 roku, to dla parafii okres rozkwitu i rozwoju fundacji parafialnych. Po przejęciu przez Uniwersytet kościół został znacząco powiększony w 2. połowie XV w. oraz ponownie w 1. połowie XVI w. W 1529 r. Zofia (Regina) Tarnowska herbu Leliwa, zakonnica z klasztoru bernardynek przy kościele św. Agnieszki, ufundowała przy kościele mansjonarię wraz z uposażeniem i domem przeznaczonym na mieszkanie dla siedmiu mansjonarzy. W 1578 r. powstał przy kościele szpital dla ubogich. Wzniesiony został przez proboszcza Marcina Radomskiego naprzeciwko kościoła, po przeciwległej stronie drogi. Już w XVI w. był to budynek murowany, piętrowy. W jego wnętrzu znajdowały się dwa ołtarze. Przed 1599 r. założono tu także Bractwo św. Anny.
Najbardziej dramatyczny okres w dziejach parafii i kościoła św. Mikołaja przypada na 2. połowę XVII w. W lipcu 1652 roku po ulewnych deszczach wylała Wisła i kościół został zalany wodą. Kilka lat później, w czasie potopu szwedzkiego kościół, probostwo i inne budynki kościelne zostały obrócone w zgliszcza. W 1656 r. Szwedzi spalili kościół, a następnie zburzyli jego mury, aby uniemożliwić oblegającym okupowane miasto prowadzenie stąd ostrzału artyleryjskiego.