Franciszek II Walezjusz zmarł 5 grudnia 1560, a teściowa Marii, Katarzyna Medycejska, została regentką w imieniu syna Karola IX. Zgodnie z warunkami traktatu edynburskiego, podpisanego przez przedstawicieli Marii 6 lipca 1560 po śmierci Marii de Guise, Francuzi wycofali się ze Szkocji i uznali Elżbietę I za władczynię Anglii. 18-letnia Maria, ciągle przebywająca we Francji, odmawiała ratyfikacji traktatu.
Powrót do Szkocji Młoda wdowa wróciła 19 sierpnia 1561 do Leith w Szkocji. Był to jednak kraj niebezpieczny, ze względu na skłócone ze sobą obozy polityczne oraz panujące konflikty religijne. Spory religijne dokonały licznych rozłamów wśród Szkotów. Brat Marii z nieprawego łoża, James Stewart, 1. hrabia Moray, stanął na czele grupy protestanckiej. Maria była natomiast zagorzałą katoliczką, co czyniło ją podejrzaną w oczach wielu poddanych oraz Elżbiety I – władczyni sąsiedniego, protestanckiego kraju. Działacz protestancki John Knox wygłaszał liczne oszczercze mowy wobec Marii, ganił m.in. jej rzekomy swobodny tryb życia, brak moralności, uczęszczanie na msze, tańczenie czy ekstrawagancki ubiór. Ku rozczarowaniu frakcji katolickiej Maria nie śpieszyła się z poparciem dla katolików oraz tolerowała brata-protestanta jako głównego doradcę.