Zgromadzenie tak wielkiej potęgi w rękach jednego człowieka niepokoiło Franciszka I, króla Francji, który został otoczony przez terytoria Habsburgów. W 1521 roku Franciszek najechał hiszpańskie ziemie we Włoszech, rozpoczynając drugi francusko-hiszpański konflikt w tym stuleciu. Wojna okazała się tragiczna dla Francji, która poniosła sromotne klęski w bitwach pod Bikkoką (1522), Pawią i Landriano. Ostatecznie agresorzy zgodzili się na przekazanie Mediolanu koronie habsburskiej.

Cesarz i król (1519–1556) thumb|upright=1.8|Zasięg imperium Habsburgów w Europie w 1540 roku Zwycięstwo Karola w bitwie pod Pawią w 1525 roku zaskoczyło Włochów i Niemców oraz potwierdziło ich obawy, iż może on poszukiwać jeszcze większej władzy i uciekać się do konfrontacji militarnych. Papież Klemens VII zmienił wówczas strony, dołączając do sił francusko-włoskich i wraz z nimi zaatakował monarchię habsburską w wojnie Ligi z Cognac. W 1527 roku Karol V, sprowokowany przez papieża, który starał się wpływać na świeckie – według Karola – sprawy, najechał i zdobył Rzym (Sacco di Roma)Z. Wójcik, Historia powszechna XVI–XVII wieku, s. 105..