Cerkiew unicka Nowa świątynia unicka, nosząca wezwanie Narodzenia Najświętszej Maryi Panny, była czynna jedynie przez kilka lat. W 1821 parafia greckokatolicka zaprzestała użytkowania budynku i wynajmowała odtąd kaplicę obrządku łacińskiego. Obiekt został ostatecznie rozebrany po tym, gdy doznał kolejnych strat w czasie powstania listopadowego.
Z uwagi na trudności czynione przez rzymskokatolickich właścicieli kaplicy dotąd wynajmowanej przez unitów, w 1840 postanowili oni zbudować własną świątynię. Po uzyskaniu niezbędnych zezwoleń oraz deklaracji hr. Stanisława Zamoyskiego o pokryciu kosztów budowy przystąpiono do prac. Kamień węgielny pod budowę pierwszej murowanej cerkwi we Włodawie został położony 14 lipca 1840. W ceremonii udział wzięło dwunastu kapłanów katolickich obrządków bizantyjskiego oraz łacińskiego. Obecny był zarządca Iwan Riendina oraz grupa kilkudziesięciu miejscowych dziedziców i urzędników sądowych. Pierwsze nabożeństwa w świątyni odbyły się w sierpniu 1843, gdy w cerkwi umieszczono wykonany przez Andrzeja Cieszyńskiego klasycystyczny ikonostas.
W 1859 w sąsiedztwie świątyni wzniesiono dzwonnicę.