Akt II W lochach siedziby Mazepy w Baturynie uwięzieni zostali Koczubej i jego zausznik Iskra. Car nie dał posłuchu doniesieniu o zdradzie Mazepy i przekazał obydwu do dyspozycji Mazepy z rozkazem ich stracenia. Orlik stara się za pomocą tortur wydobyć wiadomość o ukrytym skarbie Koczubeja. W sypialni Mazepy. Dumnego Hetmana trapią wyrzuty sumienia w związku z losem dawnego przyjaciela, a ponadto obawia się, jak zniesie egzekucję ojca ukochana Maria, śpiąca obok niego. Gdy opuszcza komnatę, do środka przedziera się Lubow i powiadamia córkę o uwięzieniu Koczubeja, prosząc, by wstawiła się w jego sprawie do Mazepy. Na miejscu kaźni zbierają się tłumy. Wśród nich Pijany kozak wykonuje obsceniczne przyśpiewki. Gdy pojawia się wóz ze skazańcami, zebrani wraz z nimi intonują hymn. Na znak Mazepy spada katowski topór. Maria i Lubow przybywają po fakcie.