Z powodów proceduralnych, broniący Hilsnera Tomáš Masaryk skierował sprawę do trybunału kasacyjnego w Wiedniu, który nakazał powtórzenie procesu. Drugi proces Hilsnera rozpoczął się w Pisku 20 września 1899. Kilka dni przed procesem więźniowie z celi, w której przebywał Hilsner, straszyli go śmiercią, żądając aby ujawnił nazwiska wspólników i przyznał się do popełnienia zbrodni. Hilsner wskazał Joshuę Erbmanna i Solomona Wassermana, jako osoby, które towarzyszyły mu w dniu morderstwa. Niefortunnie dla Hilsnera, obaj posiadali alibi – jeden był w więzieniu w dniu zabójstwa, drugi przebywał w domu dla ubogich i nie mógł w tym samym dniu dotrzeć do miejsca zbrodni.
Przed sądem Hilsner początkowo przyznał się do winy, ale potem zmienił zdanie i uznał oskarżenie za fałszywe. W czasie procesu ujawniono fakt kolejnego zabójstwa, do którego doszło w lesie Březina. Znaleziono tam zwłoki służącej Marie Klímovej, która zaginęła 17 lipca 1898. Zaawansowany stan rozkładu znalezionych zwłok nie pozwalał na ich pełną identyfikację, ale przyjęto, że są to szczątki zaginionej służącej.