Pierwsze prześladowania nadeszły w IV wieku, w Persji Sasanidów, za szacha Szapura II (341–379). Następne fale powtarzały się za panowania kolejnych szachów, przez cały V i VI wiek. Liczba męczenników sięgała tysięcy, ginęli patriarchowie, biskupi i zwykli wierni. Prześladowania nie rozbiły jednak kościoła – przeciwnie, chrzest krwi sprawił, że uciekający przed nimi chrześcijanie stawali się misjonarzami. Wraz z falami uchodźców z Persji chrześcijaństwo rozprzestrzeniło się w Arabii, na terenach dzisiejszego Kataru, Bahrajnu i Jemenu. W 356 doszło do chrztu królestwa Himjarytów w Jemenie.
Opisane warunki i zdarzenia pociągnęły za sobą odmienności w rozwoju Kościoła Wschodu. Przed przyjęciem nicejskiego wyznania wiary (w 410) Kościół Wschodu miał już własne wyznanie wiary, autorstwa Afrahata i własną anaforę świętych Addaia i Mariego, która nie zawierała Opisu Ustanowienia (anamnezy). Używano również zestawienia ewangelii (Diatessaron, tłumaczenia Tacjana), do czasu zastąpienia go pełnym tłumaczeniem Pisma Świętego na syryjski (Peszitta). Język syryjski od początku był liturgicznym językiem Kościoła Wschodu i pozostał nim do dziś, mimo że większość wiernych używała innych języków.