Onezyfor odszedł z urzędu w 1589 i rok później oznajmił o zrzeczeniu się swoich praw do monasteru. W związku z tym w 1592 Stefan Batory przekazał je prawosławnym członkom rady miejskiej Wilna.
Klasztor znalazł się pod opieką sformowanego przez nich bractwa Trójcy Świętej, które odtąd finansowało funkcjonowanie monasteru, utrzymując jego mnichów, w tym jednego hieromnicha i jednego hierodiakona. Opiekowało się także bocznym ołtarzem Spotkania Pańskiego w klasztornej cerkwi i od 1584 opłacało funkcjonowanie przy monasterze szkół brackich – dwóch szkół elementarnych i gimnazjum prawosławnego, pierwszej takiej placówki na ziemiach Rzeczypospolitej. W 1596 w drukarni klasztornej wydany został pierwszy w historii elementarz wschodniosłowiański, którego autorem był Wawrzyniec ZizaniuszT. Venclova, Wilno, R. Paknio Leidykla 2003, , s.148.