W 1601 metropolita Hipacy Pociej otworzył w monasterze kolegium duchowne, przekształcone następnie w seminarium. Jego wykładowcy oraz inni zakonnicy klasztoru czynnie angażowali się w prawosławno-unickie polemiki wyznaniowe, publikując teksty broniące unii brzeskiej. W 1605 król Zygmunt III Waza ogłosił odebranie prawosławnym radnym miasta Wilna praw do wpływania na funkcjonowanie monasteru i przekazał je jego przełożonemu, archimandrycie Samuiłowi Sieńczyło. W 1608 powołane zostało unickie bractwo Trójcy Świętej, które miało przejąć po organizacji prawosławnej wszystkie jej przywileje i obowiązki. W tym samym roku archimandryta Samuił Sieńczyło popadł w konflikt z metropolitą Hipacym Pociejem, gdy ten wyznaczył na swojego namiestnika w Wilnie Józefa Welamina Rutskiego, zwolennika latynizacji Kościoła unickiego, a następnie przeszedł do Kościoła prawosławnego. Między listopadem a lipcem 1609 trwał konflikt sądowy między unitami i dyzunitami o prawo zarządzania klasztorem, rozstrzygnięty w lipcu 1609 przez sąd przy dworze królewskim na wyjazdowej sesji na korzyść tych pierwszych. Archimandryta musiał opuścić Rzeczpospolitą, zaś na bractwo prawosławne nałożono grzywnę w wysokości 10 tys. złotych.