Wraz z ich rodzinami i personelem, liczba ta wzrosła do blisko 2000 osób.
W celu wsparcia zaopatrzenia w świeżą wodę, w murach twierdzy wprowadzono innowacyjny system kanałów i zbiorników. W serii podziemnych komór miała się zbierać woda deszczowa zebrana z dachu. W wypełnionych piaskiem kolumnach, umieszczonych w regularnych odstępach w ścianach wewnętrznych fortu, sięgających od dachu do fundamentów zbierała się woda, która była następnie filtrowana i przechowywana. System ten nie był jednak nigdy używany w praktyce, ponieważ ogromna masa ścian zewnętrznych powodowała ich osiadanie i spowodowało to pęknięcia zbiorników, pozwalając morskiej wodzie zanieczyszczać świeżą.
Użytkowanie lata 60. XIX wieku – lata 30. XX w. mały|Dziedziniec (2007) Fort pozostawał w rękach Unii podczas całej wojny domowej. Wraz z jej końcem w 1865 roku, ludność fortu spadła do 1013, składając się z 486 żołnierzy i cywilów i 527 więźniów. Zdecydowana większość więźniów w Fort Jefferson była szeregowcami osadzonymi za dezercja, w przypadku więźniów cywilnych najczęstszym przestępstwem był rabunek. Wyjątek stanowił transport czterech specjalnych więźniów w lipcu 1865 roku. Byli to doktor Samuel Mudd, Edmund Spangler, Samuel Arnold i Michael O’Laughlen, którzy zostali skazani za spisek w zabójstwie prezydenta Abrahama Lincolna.