W XVI wieku pod kierunkiem mistrza zen i opata Daitoku-ji Shun’oku Sōena (1529-1611) praktykował w tej świątyni Takuan Sōhō (1573-1645). Później został opatem zależnej od Daitoku-ji świątyni Nansō-ji. Po trzech latach, w roku 1609, został wyznaczony opatem Daitoku-jiHeinrich Dumoulin. Zen Buddhism: a History. Japan. s. 275, 276..
Daitoku-ji stała się szczególnie ważna w XVI wieku, gdy była wspierana przez członków władz siogunatu. Sponsorowali oni budowę nowych pawilonów, przygotowując je do swojej śmierci. W 1582 roku Hideyoshi Toyotomi pochował tu swojego poprzednika Nobunagę Odę. Przeznaczył również ziemię dla wybudowania Sōken-in.
W tym czasie świątynia stała się blisko powiązana z mistrzem japońskiej ceremonii herbaty – Sen no Rikyū (1522–1591), który pochodził z miasta Sakai i praktykował zen w tym klasztorze. Daitoku-ji stała się centrum kultury związanej z ceremoniałem picia herbaty. Rikyū wyrzeźbił siebie i umieścił statuę w bramie (sanmon). Hideyoshi Toyotomi był tak rozwścieczony, że został poniżony przechodzeniem poniżej tej figury, iż zmusił mistrza herbaty do popełnienia seppuku w 1591 rokuJest to zapewne tylko popularna legenda, bowiem nie wiadomo, czy Rikyū naprawdę popełnił rytualne samobójstwo.Judith Clancy. Kyoto. City of Zen. s.