poszerzono dział nauk matematyczno-przyrodniczych. Dzięki profesorowi Gotfrydowi Ernestowi Groddeckiemu, pełniącego również funkcje prefekta biblioteki w latach 1803-1825, księgozbiór usystematyzowano: wprowadzono katalog alfabetyczny, regulaminy oraz ewidencje czytelników. W okresie tym na uniwersytecie dyplom pobierał Adam Mickiewicz.
Po powstaniu listopadowym biblioteka została zamknięta a na przestrzeni lat 1832-1842, jej zbiory liczące wówczas ok. 60 tysięcy woluminów, zostały rozdzielone między biblioteki rosyjskie. Reaktywacja biblioteki nastąpiła w 1867 roku; ze zbiorów Komisji Archeologicznej i pomniejszych zbiorów powstała Wileńska Biblioteka Publiczna. Do 1915 roku była biblioteką rosyjską. Po I wojnie światowej, od roku 1919 funkcjonowała jako Biblioteka Publiczna i Uniwersytecka.
W okresie międzywojennym biblioteka przeżywała swoje odrodzenie. Pieczę nad nią sprawowali: historyk literatury i bibliofil Stefan Henryk Rygiel (w latach 1924-1929) oraz bibliograf i bibliotekarz Adam Gracjan Łysakowski (w latach 1930-1939). Za ich kadencji biblioteka w bardzo intensywny sposób powiększała swoje zasoby;