W roku 1522, po sześciomiesięcznym oblężeniu, Zakon utracił Rodos na rzecz Imperium Osmańskiego. Po kilku latach błąkania się Zakonu po Europie, cesarz Karol V zaoferował joannitom objęcie w posiadanie wysp Malta i Gozo oraz portu w Trypolisie. Zakon przybył na Maltę, wpływając na okrętach „San Giovanni”, „Santa Croce”, „San Filippo” oraz na okręcie flagowym „Santa Anna” 26 października 1530 roku.
Bazując na Malcie, Zakon i jego flota brały udział w wielu bitwach morskich przeciwko lub piratom berberyjskim. Zakon wysłał karakę oraz cztery galery, wspomagając Hiszpanów i ich sprzymierzeńców w zdobyciu Tunisu w roku 1535. Okręty Zakonu brały również udział w bitwie pod Prevezą (1538), (1541) oraz bitwie o Dżerbę (1560), w których Turcy triumfowali nad siłami chrześcijańskimi.
Cztery zakonne galery, „Santa Fè”, „San Michele”, „San Filippo” oraz „San Claudio”, zostały w roku 1551 lub 1556 (źródła podają różne daty), w Grand Harbour wywrócone przez wielkie tornado. Naprawione je za fundusze przysłane z Hiszpanii, Państwa Papieskiego, Francji oraz przeora St. Giles. Jedna galera została zbudowana na koszt Wielkiego Mistrza Claude de la Sengle.