W wyniku działania elektronów na cząsteczki wody powstaje szereg jonów, stanowiących potencjalne źródło jonów hydroniowych. Powstałe jony kierowane są następnie do specjalnej komory reakcyjnej w której zachodzi szereg reakcji prowadzących do uzyskania strumienia jonów hydroniowych o dużej czystości.
Powstały w ten sposób strumień jonów hydroniowych kierowany jest do specjalnej komory, w której następuje reakcja wymiany protonu między nimi a molekułami oznaczanych analitów, obecnych w próbce gazowej, dostarczanej do urządzenia. Przebieg tej reakcji można przedstawić w następujący sposób:
Powyższej reakcji ulegają jednak jedynie te związki, dla których powinowactwo do protonu (PA, ) jest większe niż dla cząsteczki wody (691 kJ/mol). Związki, które mają mniejsze PA, nie ulegają protonowaniu i nie są widoczne w metodzie PTR-MS. Należą do nich podstawowe gazy, z których składa się powietrze (, , i Ar) oraz większość innych związków nieorganicznych. Z kolei większość związków organicznych ulegają protonowaniu – do wyjątków należą np. alkany, etylen i acetylen. Dzięki temu, że w technice PTR-MS nie są wykrywane gazy nieorganiczne, bardzo dobrze nadaje się ona do określania zawartości śladowych ilości lotnych związków organicznych w powietrzu.