Użytkownicy rejestrują się na wybranym serwerze (instancji). Są one połączone ze sobą, a każda z nich może posiadać inne zasady. Istnieją zarówno instancje ogólnotematyczne, jak i poruszające konkretny temat (np. memy internetowe, gra komputerowa Minecraft czy ustrój polityczny). Istnieją też instancje założone przez instytucje Unii Europejskiej, rządu federalnego Niemiec, albo Massachusetts Institute of Technology.
Usługa posiada liczne ustawienia dotyczące prywatności. Każdy toot może być np. widoczny dla wszystkich, niewidoczny na osiach czasu lub trafić tylko do oznaczonych osób. Wiadomości bezpośrednie nie są jednak szyfrowane. Użytkownicy mogą oznaczyć swoje konta jako całkowicie prywatne. Wpisy mogą zawierać „ostrzeżenie o zawartości”, dzięki czemu wyświetlenie ich dalszego fragmentu wymaga rozwinięcia. Zdjęcia lub całe profile mogą być oznaczone jako nieodpowiednie w miejscu pracy (NSFW).
Mastodon dzieli wpisy pomiędzy lokalne a globalne osi czasu. Lokalne wyświetlają wpisy z obrębu pojedynczego serwera, a globalne – z całej sieci Fediwersum.