right|thumb|Toplotne mape vrijednosti ekspresije gena pokazuju kako su eksperimentalni uslovi uticali na proizvodnju (ekspresiju) iRNK za skup gena. Zelena boja označava smanjenu ekspresiju. Klusterska analiza smjestila je grupu gena sa smanjenom regulacijom u gornji lijevi ugao. U oblasti molekularne biologije, profiliranje ekspresije gena jeste mjerenje aktivnosti (ekspresija) hiljada gena odjednom, kako bi se stvorila globalna slika ćelijske funkcije. Ovi profili mogu, naprimjer, razlikovati ćelije koje se aktivno dijele ili pokazati kako ćelije reaguju na određeni tretman. Mnogi eksperimenti ove vrste mjere cijeli genom istovremeno, odnosno svaki gen prisutan u određenoj ćeliji. Nekoliko transkriptomskih tehnologija može se koristiti za generisanje potrebnih podataka za analizu. DNK-mikromreža mjeri relativnu aktivnost prethodno identificiranih ciljnih gena. Tehnike zasnovane na sekvencama, poput RNK-Seq, pružaju informacije o sekvencama gena pored njihovog nivoa ekspresije.
Pozadina Profil ekspresije logičan je sljedeći korak nakon sekvenciranja genoma: sekvenca govori šta ćelija može da uradi, dok profil ekspresije govori šta ona zapravo radi u određenom trenutku. Geni sadrže upute za stvaranje informacijske RNK (iRNK), ali u bilo kojem trenutku svaka ćelija proizvodi iRNK samo iz dijela gena koje nosi. Ako se gen koristi za proizvodnju iRNK, smatra se "uključenim", u suprotnom "isključenim". Mnogi faktori određuju da li je gen uključen ili isključen, kao što su doba dana, da li se ćelija aktivno dijeli ili ne, njeno lokalno okruženje i hemijski signali iz drugih ćelija. Naprimjer, ćelije kože, ćelije jetre i nervne ćelije uključuju (eksprimiraju) donekle različite gene i to je u velikoj mjeri ono što ih čini različitim. Stoga, profil ekspresije omogućava da se utvrdi tip, stanje, okruženje i tako dalje ćelije. Eksperimenti profiliranja ekspresije često uključuju mjerenje relativne količine iRNK eksprimirane u dva ili više eksperimentalnih uslova. To je zato što promijenjeni nivoi specifične sekvence iRNK sugeriraju promijenjenu potrebu za proteinom koji kodira iRNK, što možda ukazuje na homeostatski odgovor ili patološko stanje. Naprimjer, viši nivoi iRNK koja kodira alkohol-dehidrogenazu sugeriraju da ćelije ili tkiva koja se proučavaju reaguju na povećane nivoe etanola u svom okruženju. Slično tome, ako ćelije raka dojke eksprimiraju više nivoe iRNK povezane s određenim transmembranskim receptorom nego normalne ćelije, moguće je da ovaj receptor igra ulogu u raku dojke. Lijek koji ometa ovaj receptor može spriječiti ili liječiti rak dojke. Prilikom razvoja lijeka, mogu se izvesti eksperimenti profiliranja ekspresije gena, kako bi se pomoglo u procjeni toksičnosti lijeka, možda traženjem promjena nivoa u ekspresiji gena citohroma P450, što može biti biomarker metabolizma lijeka. Gene expression profiling may become an important diagnostic test.
Poređenje sa proteomikom Ljudski genom sadrži oko 20.000 gena koji rade zajedno, kako bi proizveli otprilike 1,000.000 različitih proteina. To je zbog alternativnog splajsovanja, a također i zato što ćelije vrše važne promjene na proteinima putem posttranslacijskih modifikacija nakon što ih prvi put konstruišu, tako da dati gen služi kao osnova za mnoge moguće verzije određenog proteina. U svakom slučaju, jedan eksperiment masene spektrometrije može identificirati oko 2.000 proteina ili 0,2% od ukupnog broja. Iako je poznavanje preciznih proteina koje ćelija proizvodi (proteomika) relevantnije od znanja koliko se informacijske RNK proizvodi iz svakog gena, profiliranje genske ekspresije pruža najglobalniju moguću sliku u jednom eksperimentu. Međutim, metodologija proteomike se poboljšava. Kod drugih vrsta, poput kvasca, moguće je identificirati preko 4.000 proteina za nešto više od jednog sata.
Upotreba u generiranju i testiranju hipoteza Ponekad naučnik već ima ideju o tome šta se dešava, hipotezu, i on ili ona izvodi eksperiment profiliranja ekspresije s idejom da potencijalno opovrgne tu hipotezu. Drugim riječima, naučnik daje specifično predviđanje o nivoima ekspresije koji bi se mogli pokazati lažnim. Češće se profiliranje ekspresije odvija prije nego što se dovoljno zna o tome kako geni interaguju s eksperimentalnim uvjetima, da bi postojala hipoteza koja se može testirati. Bez hipoteze, nema se šta opovrgnuti, ali profiliranje ekspresije može pomoći u identifikaciji kandidatske hipoteze za buduće eksperimente. Većina ranih eksperimenata profiliranja ekspresije, i mnogi trenutni, imaju ovaj oblik što je poznato kao otkrivanje klasa. Popularan pristup otkrivanju klasa uključuje grupiranje sličnih gena ili uzoraka koristeći jednu od mnogih postojećih metoda klasteriranja kao što su tradicionalno k-prosjek ili hijerarhijsko klasteriranje ili novije MCL. Osim odabira algoritma za klasteriranje, korisnik obično mora odabrati odgovarajuću mjeru blizine (udaljenost ili sličnost) između objekata podataka. Gornja slika predstavlja izlaz dvodimenzijskog klastera, u kojem su slični uzorci (redovi, gore) i slične genske probe (kolone) organizirani tako da se nalaze blizu jedan drugome. Najjednostavniji oblik otkrivanja klase bio bi navesti sve gene koji su se promijenili za više od određenog iznosa između dva eksperimentalna uvjeta. Predviđanje klase teže je od otkrivanja klase, ali omogućava odgovor na pitanja od direktnog kliničkog značaja kao što je, s obzirom na ovaj profil, koja je vjerojatnoća da će ovaj pacijent reagirati na ovaj lijek? To zahtijeva mnogo primjera profila koji su reagirali i nisu reagirali, kao i tehnike unakrsne validacije za razlikovanje između njih.
Ograničenja Općenito, studije profiliranja ekspresije izvještavaju o onima genima koji su pokazali statistički značajne razlike pod promijenjenim eksperimentalnim uvjetima. Ovo je obično mali dio genoma iz nekoliko razloga. Prvo, različite ćelije i tkiva eksprimiraju podskup gena kao direktnu posljedicu ćelijske diferencijacije, tako da su mnogi geni isključeni. Drugo, mnogi geni kodiraju proteine koji su potrebni za preživljavanje u vrlo specifičnim količinama, tako da se mnogi geni ne mijenjaju. Treće, ćelije koriste mnoge druge mehanizme za regulaciju proteina pored promjene količine iRNK, tako da ovi geni mogu ostati konzistentno eksprimirani čak i kada koncentracije proteina rastu i padaju. Četvrto, finansijska ograničenja ograničavaju eksperimente profiliranja ekspresije na mali broj opažanja istog gena pod identičnim uslovima, smanjujući statističku snagu eksperimenta, što onemogućava eksperimentu da identifikuje važne, ali suptilne promjene. Konačno, potreban je veliki napor da se raspravi o biološkom značaju svakog regulisanog gena, pa naučnici često ograničavaju diskusiju na podskup. Novije tehnike analize mikročipova automatizuju određene aspekte pridavanja biološkog značaja rezultatima profiliranja ekspresije, ali to ostaje vrlo težak problem. Relativno kratka dužina spiska gena objavljenih iz eksperimenata profiliranja ekspresije ograničava stepen u kojem se čini da se eksperimenti izvedeni u različitim laboratorijama slažu. Postavljanje rezultata profiliranja ekspresije u javno dostupnu bazu mikročipnih podataka omogućava istraživačima da procijene obrasce ekspresije izvan okvira objavljenih rezultata, možda identificirajući sličnost s vlastitim radom.
Validacija mjerenja visokog protoka I DNK-mikromreža i i kvantitativni PCR iskorištavaju preferencijalno vezivanje ili "sparivanje baza" komplementarnih sekvenci nukleinskih kiselina, i oba se koriste u profiliranju ekspresije gena, često na serijski način. Dok DNK-mikročipovima visokog protoka nedostaje kvantitativna tačnost qPCR-a, potrebno je otprilike isto vrijeme za mjerenje ekspresije gena nekoliko desetina gena putem qPCR-a kao i za mjerenje cijelog genoma pomoću DNK-mikromreža. Stoga često ima smisla izvoditi polukvantitativne eksperimente analize DNK-mikromreža, kako bi se identificirali kandidatski geni, a zatim izvoditi qPCR na nekim od najzanimljivijih kandidatskih gena, kako bi se validirali rezultati mikročipova. Drugi eksperimenti, kao što je Western blot nekih proteinskih produkata različito eksprimiranih gena, čine zaključke zasnovane na profilu ekspresije uvjerljivijim, budući da nivoi iRNK ne moraju nužno korelirati s količinom eksprimiranog proteina.
Statistička analiza Analiza podataka mikročipova postala je područje intenzivnog istraživanja. Jednostavno navođenje da je grupa gena regulirana s najmanje dva puta, što je nekada bila uobičajena praksa, nema čvrstu statističku osnovu. S pet ili manje ponavljanja u svakoj grupi, tipično za mikročipove, jedno opažanje izuzetaka može stvoriti prividnu razliku veću od dva puta. Osim toga, proizvoljno postavljanje granice na dva puta nije biološki ispravno, jer eliminira iz razmatranja mnoge gene s očiglednim biološkim značajem.
Umjesto identificiranja različito eksprimiranih gena korištenjem granične vrijednosti promjene struka, može se koristiti niz statističkih testova ili omnibus testova, kao što je ANOVA, koji svi uzimaju u obzir i promjenu struka i varijabilnost kako bi se stvorila p-vrijednost, procjena koliko često bismo slučajno posmatrali podatke. Primjena p-vrijednosti na mikročipove je komplicirana velikim brojem višestrukih poređenja (gena) koji su uključeni. Naprimjer, p-vrijednost od 0,05 se obično smatra značajnošću, jer procjenjuje 5% vjerovatnoće slučajnog posmatranja podataka. Ali sa 10.000 gena na mikročipu, 500 gena bi bilo identifikovano kao značajno pri p < 0,05 čak i ako ne bi bilo razlike između eksperimentalnih grupa. Jedno očigledno rješenje je smatrati značajnim samo one gene koji ispunjavaju mnogo stroži kriterij p-vrijednosti, npr. mogla bi se izvršiti Bonferronijeva korekcija na p-vrijednostima ili koristiti stopa lažnog otkrivanja izračun za prilagođavanje p-vrijednosti proporcionalno broju uključenih paralelnih testova. Nažalost, ovi pristupi mogu smanjiti broj značajnih gena na nulu, čak i kada su geni zapravo različito eksprimirani. Trenutne statistike poput Rangiraj proizvod imaju za cilj da postignu ravnotežu između lažnog otkrivanja gena zbog slučajne varijacije i neotkrivanja različito eksprimiranih gena. Često citirane metode uključuju Analizu značajnosti mikročipova (SAM) i širok spektar metoda dostupan je od Bioconductor i razni analitički paketi od bioinformatičke kompanije. Odabir drugog testa obično identificira drugačiju listu značajnih gena budući da svaki test funkcionira pod specifičnim skupom pretpostavki i stavlja drugačiji naglasak na određene karakteristike u podacima. Mnogi testovi počinju s pretpostavkom o normalnoj distribuciji u podacima, jer se to čini kao razumna početna tačka i često daje rezultate koji izgledaju značajnije. Neki testovi uzimaju u obzir zajedničku distribuciju svih opažanja gena kako bi procijenili opću varijabilnost u mjerenjima, dok drugi posmatraju svaki gen izolovano. Mnoge moderne tehnike analize mikročipova uključuju samostalno korištenje, mašinsko učenje ili Monte Carlo metode. Kako se broj ponovljenih mjerenja u eksperimentu s mikročipovima povećava, različiti statistički pristupi daju sve sličnije rezultate, ali nedostatak podudarnosti između različitih statističkih metoda čini rezultate nizova manje pouzdanim. MAQC projekt daje preporuke koje će istraživačima pomoći u odabiru standardnijih metoda (npr. korištenje p-vrijednosti i promjene amplitude zajedno za odabir različito eksprimiranih gena) kako bi se eksperimenti provedeni u različitim laboratorijama bolje slagali.