miniatura|Representació tridimensional del nucli hetero-trimèric del complex LUBAC, format per HOIP, HOIL-1L i SHARPIN (Font: Protein Data Bank o RCSB-PDB) El complex LUBAC, (de l'anglès: Linear Ubiquitination Assembly Complex), és l'únic complex d'ubiquitina ligasa (E3) que catalitza la conjugació lineal d'ubiquitina en determinades dianes o substrats proteics. La funció principal d'aquest complex és realitzar ubiquitinacions; modificacions post-traduccionals que permeten o bé marcar les proteïnes per a la seva degradació a través de proteosomes o alterar la localització de la proteïna dins la cèl·lula o, forçar o impedir diferents interaccions interproteiques. Es tracta d'un complex heteromultimèric format per tres subunitats diferents anomenades HOIL-1L, HOIP, i SHARPIN.
Funcions miniatura|En la ubiquitinació, l'enzim activador d'ubiquitina (E1) la transfereix a l'enzim conjugant (E2). La ubiquitina ligasa (E3) transfereix les molècules d'ubiquitina al substrat, generant cadenes lineals que intervenen en nombrosos i importants processos cel·lulars. |280x280px
Ubiquitinació La ubiquitinació és un procés enzimàtic de modificació post-traduccional proteica que té com a funció marcar proteïnes per a la posterior degradació de les mateixes al proteosoma, i que, en diversos casos, pot comportar un canvi fisiològic en el substrat.
Inclou l'acció dels complexos enzimàtics E1, E2 i E3.
Es produeix l'activació de la ubiquitina amb consum d'ATP mediada per l'enzim E1, ja que en el seu centre actiu hi ha una cisteïna que s'uneix mitjançant un enllaç tioèster a la glicina de l'extrem C-terminal de la ubiquitina que requereix una despesa energètica. Es transfereix la ubiquitina del centre actiu de l'enzim E1 a l'enzim E2 a través d'una reacció molt similar a l'anterior. Les ligases E3 finalitzen el procés unint la ubiquitina a una lisina del substrat i confereixen especificitat mitjançant la selecció de la proteïna objectiu.
Mecanisme de funcionament LUBAC El complex LUBAC forma part de la família d'ubiquitina ligases E3 RBR (de l'anglès RING-between-RING) i malgrat fer la funció de poliubiquitinació d'aquesta família enzimàtica divergeix en diversos aspectes. Aquest complex és l'única ligasa E3 que realitza un procés de poliubiquitinització lineal, és a dir, forma enllaços peptídics entre l'extrem C-terminal de la glicina d'un monòmer d'ubiquitina amb l'extrem amino-terminal de la metionina del monòmer següent (formant el Met1-Ub).
L'activitat catalítica del complex LUBAC es concentra a la subestructura HOIP, mentre que les subunitats SHARPIN i HOIL-1L tenen importància en el context cel·lular tot i no dur a terme el procés d'ubiquitinació. Aquestes són imprescindibles per a la localització i l'especificitat del substrat, i també s'han relacionat amb processos d'activació del complex per atorgar-li una major estabilitat.
La presència de domini PUB a l'extrem N-terminal de la subunitat HOIP permet al complex la interacció amb desubiquitinases (DUBs) fet que explica un procés d'autoregulació per contrarestar l'activitat del complex LUBAC. Diversos processos específics de proteòlisi també tenen capacitat de regular l'activitat catalítica del complex LUBAC. miniatura|Regulació de la via metabòlica del complex proteic NF-kB. S'observen els passos fonamentals d'activació del complex NF-kB. (1) Es produeix la unió lligand-receptor. (2) La unió lligand-receptor indueix la síntesi de cadenes Met1-Ub. (3) La proteïna NEMO s'ubiquitina amb les cadenes Met1-Ub. (4) La proteïna ubiquitinada NEMO activa la quinasa IKKα/β. (5) La quinasa, al mateix temps, activa el complex NF-kB, el qual participa en vàries respostes cel·lulars. Un cop s'ha produït l'activitat catalítica, la quinasa es degrada en un proteosoma.
La complexitat del LUBAC genera un gran seguit d'incògnites sobre la seva funcionalitat; actualment, s'han trobat diverses competències específiques de les subunitats; en el cas del HOIL-1L, s'ha descrit la seva importància en vies metabòliques com són la regulació del cicle cel·lular, l'emmagatzematge intracel·lular de ferro i l'adaptació de la cèl·lula a la hipòxia en tumors de creixement ràpid. L'altre component del LUBAC, el SHARPIN presenta una activitat catalítica important relacionada amb els processos d'apoptosi no regulada; del que es dedueix que el complex té una gran importancia en el funcionament d'aquests mecanismes. Tots ells regulats per processos d'ubiquitinació.
Regulació de NF-kB La ubiquitinació de diversos substrats per l'acció del LUBAC provoca l'activació de vies metabòliques rellevants per al correcte funcionament cel·lular. La via metabòlica del complex NF-kB constitueix la funció més important que regula el LUBAC fins ara coneguda.
El NEMO, un component del complex IkB quinasa, és el substrat principal del LUBAC, i la seva ubiquitinació activa el complex proteic NF-kB. Quan un receptor rep un estímul determinat, provoca l'activació del complex LUBAC el qual ubiquitinitza el complex NEMO unint-hi una cadena Met1-Ub. Aquest, quan es troba unit a la cadena d'ubiquitina, és capaç d'estimular les quinases IkBα reguladores dels processos relacionas amb l'NF-kB. Quan aquesta via metabòlica és estimulada, incideix en respostes immunitàries i actua contra l'estrès, així com en processos d'inflamació. La regulació del procés implica també una via de retorn, de manera que si es presenta un excés de NF-kB, el mateix LUBAC es veu contrarestat per l'activitat de les deubiquitinases (DUB) i es redueix la sortida final de Met1-Ub. Es pot dir, per tant, que s'estableix un equilibri de Met1-Ub quan les concentracions d'aquesta són elevades.
Estructura La molècula té un pes d'aproximadament 600 kD, xifra suggereix que es tracta d'un complex heteromultimèric format, per tres subunitats. Inicialment, quan l'any 2006 es va descobrir, es creia que únicament constava de dues subunitats que contenen les proteïnes HOIP i HOIL-1L. Més endavant, però, es va poder descriure un tercer domini: la proteïna SHARPIN. miniatura|Els dos dímers (LUBAC-I i LUBAC-II) són menys estables i menys eficients que el complex LUBAC que es troba com a trímer on s'estableixen interaccions entre les subunitats SHARPIN i HOIL-1L.
El HOIP és la principal d'entre les tres subunitats del LUBAC. Aquest conté mecanismes suficients per ubiquitinitzar proteïnes per sí sol; malgrat això, s'ha observat que només és capaç de dur a terme aquesta funció quan es troba unit a una de les seves dues subunitats complementàries o bé a ambdues alhora. En la subunitat HOIP aïllada es dona una autoinhibició recíproca entre el seu domini UBA i la seva regió RBR-LDD, el que implica l'aturada de la seva activitat catalítica. És per això que el complex es presenta sempre com a dímer o trímer; el HOIL-1L i SHARPIN s'encarreguen de desinhibir i reactivar les funcions de la subunitat principal enllaçant-se a ella
D'aquesta manera, el domini UBA del HOIP s'uneix específicament a la subunitat HOIL-1L i el domini UIM a la SHARPIN, formant així dos microcomplexos: el HOIL-1LUBL/HOIPUBA i el SHARPINUBL/HOIPUIM. Aquest enllaç entre HOIP i les altres dues subunitats és mediat principalment per interaccions hidrofòbiques De fet, tot i que SHARPIN i HOIL-1L comparteixen una gran similitud, ja que tenen residus molt semblants que són responsables d'aquest enllaç amb HOIP, el mode d'interacció del complex SHARPINUBL/HOIPUIM és totalment diferent que el del complex HOIL-1LUBL/HOIPUBA. Així doncs, és el domini HOIP qui adopta diferents conformacions per tal d'interaccionar amb cadascuna de les subunitats de manera específica.
El complex pot trobar-se expressat de tres maneres diferents:
HOIP enllaçat al HOIL-1: complex dimèric conegut com a LUBAC-I o HOIL-1L/HOIPUBA.
HOIP enllaçat al SHARPIN: complex dimèric conegut com a LUBAC-II o SHARPINUBL/HOIPUIM. HOIP enllaçat a HOIL-1 i SHARPIN: complex trimèric conegut com a complex LUBAC.
miniatura|Estructura de les diferents components del LUBAC complex i senyalització dels dominis entre els que es produeixen els enllaços entre la unitat principal (HOIP) i les dues subunitats secundàries (HOIL-1L i SHARPIN). Es veu marcat també el centre catalític de la unitat HOIP on es produeix la ubiquitinació.
D'aquestes tres conformacions possibles la més estable és la que es troba com a trímer; l'absència d'alguna de les dues subunitats (HOIL-1L o SHARPIN) o la mutació d'alguna d'aquestes, desestabilitza parcialment en el conjunt que limita la seva efectivitat tot i que no la impedeix. L'existència de les dues conformacions dimèriques s'ha aconseguit únicament en cèl·lules cultivades in vitro. HOIP La proteïna HOIP (HOIL-1L interacting protein) és coneguda amb aquest nom perquè en un inici aquestes dues subunitats van ser les primeres en ser identificades com a membres del complex LUBAC, però també es coneix amb el nom de NFR31. Aquesta proteïna pertany a la família RBR (RING-between-RING) de les ligases E3, caracteritzades per un domini RING ampliat (RING1) seguit d'un domini de 'RING in-between RING' (IBR) i un domini catalític (RING2).
HOIP, un dels RBRs més estudiats, és l'E3 ligasa essencial del LUBAC, ja que és el component catalític d'aquest complex. Es tracta d'un RBR prototípic, encara que conté un RING2 ampliat que inclou el domini de determinació de la cadena d'ubiquitina lineal (LDD), que permet la formació selectiva d'enllaços lineals d'ubiquitina (RING2L).
Consta de 1072 aminoàcids i presenta dos dominis principals: el PUB i l'UBA. El primer dels dos conforma des de l'aminoàcid 71 fins al 142, i és un domini que s'ha detectat en altres proteïnes també relacionades amb la degradació de substrats al proteasoma i s'encarrega d'interaccionar amb l'enzim VCP. D'altra banda, en el domini UBA és on es dona la interacció amb el domini UBL de la subunitat HOIL-1L, i es troba des de l'aminoàcid 564 fins al 615.
La subunitat HOIP, doncs, actua com a ligasa E3 i s'encarrega de formar cadenes lineals de poliubiquitina. És per això que en la seva estructura podem identificar dits de zinc per a realitzar aquesta funció. Aquests sumen un total de sis: tres d'ells del tipus RanBP2, que regulen la interacció amb la ubiqüitina, i els altres tres del tipus RING. Els dominis RING1 i IBR s'encarreguen de catalitzar el pas de la ubiquitina des de la ligasa E2 fins al RING2, i posteriorment el RING2 duu a terme la unió final de la ubiquitina amb l'extrem N-terminal del substrat.
Pel que fa a l'estructura secundària, en aquesta proteïna hi predomina la conformació d'hèlix alfa, de la qual trobem 33 seqüències d'entre 22 i 3 aminoàcids cadascuna, així com 21 seqüències de conformacions làmina beta d'entre 3 i 8 aminoàcids.
L'HOIP-RBR aïllat es manté en un estat autoinhibit, però la seva unió amb el component HOIL-1L del LUBAC activa HOIP per impulsar, juntament amb SHARPIN, la senyalització de la via NF-κB i altres processos cel·lulars de gran importància.
HOIL-1L És una proteïna codificada pel gen RBCK1 situat en la posició 13 del braç curt del cromosoma 20 del genotip humà. És la isoforma més expressada en l'organisme de la HOIL-1, de la que se'n diferencia per ser més llarga. Té un pes molecular de 56,1 kDa, i la seva cadena peptídica consta de 510 aminoàcids que conformen una estructura terciària amb set làmines beta, tres hèlixs alfa, un gir de tres aminoàcids i una superhèlix de 29 aminoàcids. miniatura|Il·lustració en la que s'indica la posició en la seqüència d'aminoàcids de les diferents conformacions tridimensionals. De color rosa estan indicades les hèlix alfa, de taronja les làmines beta i de color blau el gir.